細胞や組織の内部で起こる複雑な現象を解明するためには、三次元的な空間情報を迅速に取得する体積イメージングが極めて重要である 。この技術は、高い空間分解能を維持しながら時間軸に沿った情報を保存できるため、細胞内の微細構造や動態を効果的に調査することを可能にする 。その中でも、特定の深さの体積情報を一層の平面に投影して単一露光で取得する「2.5次元顕微鏡」は、極めて高い撮影速度と光検出効率を両立する革新的な手法として注目されている 。この顕微鏡は「レイヤーケーキ」と呼ばれる多層ガラスを用いた受動的な光学素子を利用しており、光の波面を非干渉的に分割することで、九十五パーセント以上の高い透過率を実現する 。これにより、従来の空間光変調器を用いる手法に比べて光の損失が少なく、低光量での撮影が可能なため、細胞への光毒性や蛍光色素の退色を最小限に抑えた長期間の生細胞観察を実現できる優れた特性を有している 。また、ナノメートル規模の精度で分子の位置を特定する単一分子局在化顕微鏡や、個々の分子の動きを追跡する単一粒子追跡法は、生命科学における定量的な解析において不可欠な役割を担っている 。

　しかし、従来の体積イメージングは、重い対物レンズや試料台を垂直方向に物理的に動かす走査方式に依存しており、撮影速度が装置の移動速度に制限されるという課題がある 。また、多焦点面を同時に撮影する手法では、光の利用効率が著しく低下したり、信号対雑音比が悪化したりする問題が指摘されている 。2.5次元顕微鏡においても、投影時に広範囲の焦点外背景光が像に混入することで、特に信号が微弱な単一分子の検出精度が低下し、粒子追跡において焦点外へ逃げる分子を捉え続けられないという欠点があった 。

　そこで、本研究では高傾斜層状光シート照明（HILO照明）を導入することで、焦点外の背景光を約二分の一に低減し、高感度かつ高解像度な体積イメージングを実現した 。光源には多色蛍光標識された微小管の励起や、単一分子の精密な局在化および活性化を目的として、Cobolt社製のレーザー（波長488, 561, 638, 640, 405 nm）が使用された 。その結果、垂直走査を行うことなく三から四マイクロメートルの深さを一括で投影撮影することに成功し、生細胞内における単一粒子の追跡時間を約四倍に延長できることを実証した 。

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論文で使用されたCoboltのレーザー

本研究において使用されたCobolt社製のレーザーは、488 nm、561 nm、638 nm、および高出力の640 nmレーザーであり、単一分子観察や多色蛍光イメージングのために用いられた。特に、640 nmレーザー（Cobolt Bolero）はSMLMにおける強励起用として利用された。また、405 nmの活性化用レーザーもCobolt社製であり、単一分子のスパースな活性化を制御するためにファンクションジェネレータと組み合わせて使用された。

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　ライトシート蛍光顕微鏡（LSFM）は、近年、組織透明化技術と組み合わせることで、組織、臓器、さらには全身の三次元（3D）イメージングにおいて急速に研究が進められている。特に、選択面照明顕微鏡（SPIM）やデジタルスキャニングライトシート顕微鏡（DSLM）は、組織透明化技術が普及する以前から、小型で透明な標本の3Dおよび4Dイメージングに使用されてきた。これらの技術は、ガウシアンビームを集光して励起ライトシートを生成し、軸方向の空間分解能と有効視野（eFOV）のトレードオフを引き起こすが、タイルリングLSFMや軸方向スイーピング方式によって、軸方向の空間分解能を維持しつつeFOVを拡大することに成功している。さらに、BesselビームやAiryビーム、光格子ベースのライトシートなど、非回折ライトシートを利用する最新のアプローチも報告されている。これにより、LSFMは迅速でボリュームのあるクリアな組織イメージングに最適化されている。

　しかし、LSFMシステムの限られたアクセス性は、多くの組織透明化技術のエンドユーザーにとって大きな障害となっている。市販システムは使いやすさを提供する一方で、個々の研究グループにとっては高額であるため、導入が困難である。また、最先端のカスタムビルド顕微鏡は、高度な光学知識を必要とし、構築が難しい。さらに、多くのLSFMは励起および検出対物レンズの直交配置を採用しており、標本のサイズや取り付けに物理的な制約がある。従来の標本ホルダーである培養皿やウェルプレートは、顕微鏡に容易に収容することができないため、操作性に課題がある。

　そこで、本研究では、descSPIM（デスクトップ装備のSPIM：cleared標本用）を提案する。descSPIMは低コスト（20,000～50,000ドル）、低専門知識（非専門家による1日での設置可能）でありながら、実用的なDIYライトシート顕微鏡である。このシステムは、基本的なSPIM構成を採用し、単一ベンダー（Thorlabs）から購入可能な約90の部品で構成されており、ユーザーの利便性を考慮している。シングルモードファイバーガイドのレーザー光をコリメートし、円筒レンズを用いてシート照明を形成する。ユーザーは実験目的に応じてカラーバリエーションを選択可能で、マルチチャネルイメージングに対応している。さらに、基本構成を用いても、3.45×3.45×7-25 µm³のボクセル解像度で効率的な3Dイメージングが可能であり、迅速な3Dイメージングを実現する。

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ライトシート顕微鏡で使用されたCobolt Skyra

Bodén, A., Ollech, D., York, A. G., Millett-Sikking, A., & Ilaria Testa. “Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy.” Nature Methods 2024, 21, 882-888. https://doi.org/10.1038/s41592-024-02196-8

　光シート蛍光顕微鏡法（LSFM）は、標本に対して薄い光の面を照射し、その焦点面からのみ蛍光を検出する手法であり、多細胞系の四次元的な生体観察において極めて重要な役割を果たしている 。この技術は、高速な立体撮影が可能であると同時に、標本への光照射量を最小限に抑えられるため、生細胞の長時間観察に適している 。また、斜め平面顕微鏡法（OPM）は単一の対物レンズを用いて照明と検出を行う手法であり、従来の顕微鏡用スライドガラスや多ウェルプレートに置かれた標本への接近性に優れている 。回折限界を超える解像度を実現する超解像技術の一種である可逆飽和光蛍光遷移（RESOLFT）顕微鏡法は、特定の波長の光によって蛍光を発する「オン」状態と発しない「オフ」状態を切り替え可能な可逆光スイッチング蛍光タンパク質（RSFP）を利用する 。RSFPは、比較的低強度の光照射で状態遷移を誘起でき、その状態は外部からの刺激がない限り長時間安定して維持される特性を持つ 。これらの技術の融合は、細胞内の細かな構造を高い空間分解能で捉えるために非常に有効な手段である。

　しかし、光の回折という物理的な性質により、高い開口数を持つ光学系を用いても、標本内を伝播する光シートの厚みを約一マイクロメートル以下に抑えることは困難である 。この厚みは1 µmから10 µm程度の細胞小器官を詳細に観察するには不十分であり、深部方向の分解能が制限される 。また、光シートを薄くしようとする従来の試みでは、光の検出効率の低下や標本への接近の難しさ、さらには過度な状態遷移の繰り返しによる撮影速度の低下や標本への悪影響といった課題が存在している 。

　そこで、本研究では複数の薄い光の面を同時に形成するマルチシートRESOLFT法を開発し、これらの課題を解決した 。この手法は、周期的な光の紋様を用いて標本内の蛍光タンパク質を立体的に並列処理し、回折限界を大幅に下回る100 nm以下の極めて薄い発光層を生成する 。撮影に必要な状態遷移の回数を10から20回程度に抑えることで、1 Hzを超える高速な立体撮影と光毒性の低減を両立させた 。装置にはCobolt社製のレーザー発振器を2種類導入し、488 nmの波長を蛍光の励起およびオフ状態への切り替えに、405nmをオン状態への切り替えに使用した 。これにより、微小管や細胞分裂の様子、ウイルス様粒子の動態を、従来の限界を超える鮮明さで捉えることに成功した 。

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論文で使用されたCoboltのレーザー

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Stefaniuk, M., Gualda, E. J., Pawlowska, M., Legutko, D., Matryba, P., Koza, P., Konopka, W., Owczarek, D., Wawrzyniak, M., Loza-Alvarez, P., Kaczmarek, L. “Light-sheet microscopy imaging of a whole cleared rat brain with Thy1-GFP transgene.” Scientific Reports 2016, 6, 28209. https://doi.org/10.1038/srep28209

　脳全体の神経回路網を細胞単位の解像度で詳細に描出することは、複雑な行動や生理現象の基盤となる構造を理解するために極めて重要である 。広範囲の組織を高速かつ高精細に可視化するライトシート顕微鏡法は、薄いシート状の励起光を用いて標本を面ごとに順次走査する技術であり、従来の点走査型顕微鏡に比べ圧倒的な速度で三次元画像を構築できる利点を持つ 。また、組織内の光散乱の主因である屈折率の不均一性を化学的に解消し、不透明な生体組織を光が透過する状態にする組織透明化技術も飛躍的に進歩している 。神経細胞に緑色蛍光タンパク質を発現させるThy1-GFP導入遺伝子技術を組み合わせることで、個々の細胞形態や樹状突起の微細構造に至るまで、生体内の位置情報を保ったまま三次元的に追跡することが可能である 。これらを統合することにより、広範な脳領域にわたる神経投射を網羅的に解析する定量的解剖学が実現し、脳機能の解明に向けた研究が世界中で加速している 。

　しかし、脳組織における光の散乱は物理的な観察深度を著しく制限するため、従来の全脳観察は薄く切断した大量の組織切片を個別に撮像し、後に計算機上で再構築するという多大な労力と時間を要する手法に依存していた 。加えて、既存の多くの組織透明化手法は主にマウスの脳を対象として最適化されており、マウスよりも脳体積が大きく、かつ光を散乱しやすい髄鞘成分が豊富な成体ラットの脳に対しては、十分な透明度を得ることが極めて困難であった 。代表的な透明化手法であるCUBIC法やPACT法をラット全脳に適用しようとすると、長期間の処理が必要となり、その過程で重要な蛍光信号が消失したり、組織の過度な膨張によって屈折率が乱れ、画像が著しく歪んだりするという深刻な課題が存在していた 。

　そこで、本研究では独自に作製したThy1-GFP導入ラットを用い、溶媒置換に基づくFluoClearBABB法を採用することで、蛍光を維持しながら成体ラット脳の高度な透明化に成功した 。本手法の有効性を検証するため、励起光源として安定した出力を持つCobolt社製の連続波発振レーザー（波長488ナノメートル）を組み込んだライトシート顕微鏡を構築し、透明化標本内の神経細胞を効率的に励起・観察した 。この装置により、広視野での全脳構造の把握と、高い数値開口数を持つレンズによる特定部位の微細構造観察を同一標本で行うことが可能となった 。その結果、大型の成体ラット脳半球全体の神経ネットワークを、細胞レベルの解像度で三次元描写する簡便かつ低費用な解析手法が確立された 。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

原文

論文で使用されたCoboltのレーザー

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