半導体を基盤とするフォトニック集積回路は、微小スケールで光を操作する高密度な基盤として、光通信、非線形光学、量子フォトニクス、生体センシングなど幅広い応用が期待されている。特に窒化ケイ素（Si₃N₄）は広い透過波長域、低伝搬損失、CMOS製造工程との互換性から有望な光導波路材料として注目されている。これらの回路の性能を最大化するには、導波路内部の共鳴モード、すなわち光場の空間分布を詳細に把握することが不可欠である。現在、こうした電磁共鳴モードの二次元的特性評価には、近接場光学顕微鏡（NSOM）や電子エネルギー損失分光（EELS）イメージングが主に用いられている。

　しかし、NSOMAやEELSは視野が狭く、高価かつ複雑な装置を必要とするため、産業的な大規模検査には適していない。一方、遠視野光学顕微鏡は非接触で広範囲の観察が可能であるが、回折限界により誘電体ナノ構造内部の共鳴モード微細分布の可視化には至っていなかった。

　そこで、本研究ではレーザー走査型飽和励起（SAX）顕微鏡法を適用し、光熱非線形散乱信号を抽出することで、この問題を解決した。Si₃N₄ナノワイヤにおいて、共鳴モードの腹の位置で光吸収が増大し、熱光学効果による散乱非線形性が生じることを実験的に確認した。3次非線形散乱信号を用いた画像再構成により、空間分解能を1.7倍向上させ、従来の遠視野光学顕微鏡では観察不可能であった周期的共鳴モード分布の可視化に成功した。光源には波長561 nmのCobolt社製連続波レーザー（Cobolt Jive）を用い、ナノワイヤの光熱非線形散乱応答を誘起するための励起光として使用した。

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レーザー走査型飽和励起顕微鏡法に使用された561nmレーザー

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　蛍光顕微鏡法は生細胞イメージングにおいて重要な手法であり、特に回折限界を超える空間分解能を実現する超解像顕微鏡法の発展により、細胞内微細構造の可視化が可能となった。光照射により発光状態と非発光状態を可逆的に切り替えることができる可逆的光スイッチング蛍光タンパク質（RSFP）は、RESOLFT法や非線形構造化照明顕微鏡法などの超解像技術、さらには発光特性の違いを利用した多重標識イメージングにおいて広く活用されている。RSFPの光スイッチング機構は発色団のシス-トランス異性化とプロトン化・脱プロトン化に基づいており、数千回以上のオン-オフサイクルを繰り返せることが高品質な画像取得の鍵となる。

　しかし、RSFPは繰り返しの光照射により蛍光強度が徐々に低下する光スイッチング疲労（光退色）を示し、これが長時間撮影や超解像イメージングの大きな障壁となっていた。従来の光退色低減手法は培地への化学薬品添加や培地組成の最適化に依存しており、生理的条件を損なう可能性があった。

　そこで、本研究ではrsEGFP2を中心にRSFPの光退色経路を詳細に解析し、三重項状態を経由する経路とオンスイッチング過程に由来する経路の二つを同定した。オンスイッチング光の照射時間を延長し出力密度を下げることで初期蛍光低下を抑制し、さらに592 nmまたは915 nmの光を同時照射することで三重項状態からの逆項間交差を促進し、光退色を最大15〜20%回復させた。この手法を並列化共焦点顕微鏡およびRESOLFT超解像顕微鏡に適用し、生細胞における長時間タイムラプス撮影を実現した。Cobolt社製の405 nm、488 nm、および915 nmレーザーは、それぞれオンスイッチング、蛍光励起・オフスイッチング、および三重項状態の光誘起脱励起に使用された。

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RESOLFT超解像顕微鏡に使用された405nm, 488nm, 915nmレーザー

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　全反射照明蛍光（TIRF）顕微鏡法は、ガラスと試料の界面で全反射を起こし、エバネッセント波によって試料表面から数百ナノメートル以内の蛍光分子のみを励起する手法であり、高い信号対背景比で生体試料の表面構造を可視化できることから、細胞生物学分野で広く活用されている。対物レンズ型TIRFでは、開口数1.4以上の対物レンズを用い、励起光を対物レンズの後焦点面の最外周部（TIRF領域）に集光することで全反射条件を満たす。複数のファイバを融合・テーパ加工して単一のマルチモード入力から複数の単一コア出力へ低損失で光を分配する導波路素子であるフォトニックランタンは、光コヒーレンストモグラフィや計算イメージングなど様々な撮像応用に利用されてきた。

　しかし、従来のTIRF顕微鏡法では、励起光が試料の構造物によって遮られることで散乱や影の偽像が生じる問題があった。これを防ぐために走査鏡やデジタルミラー素子などの走査装置を用いて励起光を回転させる手法が提案されてきたが、装置構成が複雑化し精密な調整が必要となる欠点があった。また、環状マスクやアキシコン光学系を用いる方法は光損失が大きく、環状ファイバ束を用いる方法は結合損失が避けられず、高出力励起を必要とする超解像顕微鏡法には不向きであった。

　そこで、本研究では9本の出力コアを環状に配置したフォトニックランタンを設計・作製し、走査装置を用いることなく9方向から同時にTIRF励起を行う手法を開発した。この手法により、結合効率91%以上を達成しつつ、50×50 μm²の視野にわたって均一な照明を実現した。Cobolt社製640 nm半導体レーザー（Bolero）は単一分子局在顕微鏡法における励起光源として使用され、Alexa Fluor 647で標識した微小管の超解像撮像において、視野全体で平均局在精度約17〜19 nmの高品質な画像取得を可能にした。さらに、生細胞の小胞体動態の無影撮像にも成功し、本手法の実用性が実証された。

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全反射照明蛍光TIRFで使用された640nmレーザー

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　水で膨潤したコロイド状の架橋高分子網目構造である微小ゲルは、生体触媒を含む様々な応用において有望な材料として近年急速に研究が進められている。微小ゲルは多孔質構造と高い含水率により酵素の安定性を向上させ、活性を維持しながら効率的な再利用を可能にする。特にP450モノオキシゲナーゼ※は、脂肪酸の水酸化やエポキシ化など幅広い酸化反応を触媒する能力を持ち、バイオテクノロジー分野で高い価値を有する酵素群である。酵素を微小ゲル内に固定化することで、触媒効率の向上や回収・再利用の容易化が期待される。また、光の回折限界を超えた空間分解能を実現する超解像蛍光顕微鏡法は、軟質物質や高分子、特に微小ゲルの解析に有用な手法として発展してきた。

※P450は鉄を含むヘムタンパク質であり、一酸化炭素と結合した際に450 nmの波長で特徴的な吸収を示すことからこの名称がつけられた。主に酸化反応を触媒する酵素であり、酸素分子の一方の酸素原子を基質に導入し、もう一方を水に還元する「モノオキシゲナーゼ」として機能する。

　しかし、従来の酵素担持量の測定は活性に基づく一括測定法に限られており、微小ゲル内での酵素の空間分布を把握することができなかった。そのため、触媒活性が微小ゲル内の位置に依存するかどうかを調べることは不可能であり、酵素が殻部・中心部・全体のいずれに偏在するかという情報も得られなかった。

　そこで本研究では、三種類の位置特定型超解像蛍光顕微鏡法を組み合わせることで、単一酵素の位置と局所活性の関係を解明した。ナイルレッドを用いたPAINT法で微小ゲルの高分子構造を可視化し、Alexa Fluor 647標識酵素のdSTORM法で酵素位置を特定し、NASCA法で局所触媒活性を測定した。PAINT法およびNASCA法における励起光源としてCobolt社製Samba 532 nmレーザーを、dSTORM法にはCobolt社製Rouge 640 nmレーザーを使用した。その結果、シトクロムP450 BM3酵素は微小ゲル全体に分布し、活性は概ね保持されるものの、周辺部において中心部より有意に高い触媒活性を示すことが明らかとなった。

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超解像顕微鏡法dSTORMで使用された532nmと640nmレーザー

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　単一分子および超解像顕微鏡法は、複雑な生物学的システムの観察範囲を大幅に拡大してきた。特に、Moonらの研究では、超解像とスペクトルイメージングの組み合わせにより、30 nmの空間解像度で生きた哺乳類細胞の異質性を明らかにし、オルガネラおよび細胞膜の化学的極性の違いをコレステロールレベルの違いとして示した。また、DeguchiらはMINFLUX技術を用いて、リビングセル内でキネシン-1モータータンパク質が微小管上を移動する際の8 nmのサブステップを観察した。さらに、ReinhardtらはDNAバーコーディング手法を用いて、超解像法の空間解像度をÅレベルまで向上させ、全細胞内でのバイオ分子の観察およびDNA骨格内の単一塩基間の距離を分解することに成功した。これにより、超解像顕微鏡法と構造生物学の長さスケール間のギャップが縮まり、正確な構造理解が生きた細胞および複雑な組織にもたらされる可能性が開かれた。これらの手法はすべて、単一の蛍光スポットまたはプンクタの検出に依存しており、弱い信号でも検出するための多くの努力が払われている。
　さらに、単一の蛍光プンクタの識別に加えて、大規模な周囲の細胞環境も同時に検出することが有利である。これにより、研究者は単一の分子（タンパク質、DNA、RNAなど）を調査するだけでなく、それらの環境内での相互作用および局在を理解することができる。例えば、単一分子蛍光原位ハイブリダイゼーション（smFISH）技術は、生物学的環境内でRNAを視覚化することを可能にし、RNAが単一の明るい蛍光プンクタとして検出され、細胞または細胞内環境が同時にイメージングされる。smFISHはRNAの局在および追跡の理解を大幅に向上させ、Allen Brain Atlasプロジェクトなどの大規模マッピングプログラムに依存する技術の一つとなっている。

　しかし、これらの実験には背景を正確に検出および補正するという根本的な課題が存在する。多くの従来の単一分子および超解像実験では、サンプル選択および準備が不要な背景信号を最小限に抑えるように選ばれることが一般的である。背景信号は、エミッタや散乱体からの不要な光子や、ターゲット分子/プロセスに関連しないカメラ読み出しノイズの組み合わせであり、これがプンクタ検出を困難にしている。

　そこで、本研究ではRASP（Radiality Analysis of Single Puncta）を提案し、この問題を解決した。RASPはバイオイメージングセグメンテーション手法であり、他の解析方法が検出する誤検出プンクタを除去し、単一タンパク質から複雑な細胞表現型まで広範な空間スケールで特徴を検出する。RASPは、画像の勾配を使用してガウス形状のオブジェクトを背景から分離することで、最先端の方法よりも精度と速度で優れていることを示した。人間の脳におけるミクログリア、ニューロン、およびα-シヌクレインオリゴマー間の空間相関を抽出することで、RASPの能力を実証した。この感度が高く計算効率の高いアプローチにより、細胞および組織環境内で蛍光プンクタおよび細胞特徴を区別することが可能となり、単一タンパク質レベルの感度まで達成した。

　Coboltのレーザーは、これらの実験において、特に488 nmおよび561 nmのレーザーを用いて蛍光照明を行うために使用された。これにより、背景信号を最小限に抑えつつ、対象の蛍光シグナルを効果的に励起することができた。
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超解像顕微鏡法に使用されたCoboltのレーザー

本レーザーはレーザーコンバイナー C-FLEXに搭載された使用されました。

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　分子複合体の形成や局所環境の変化を検出する手法として、蛍光異方性測定は生命科学分野で広く利用されている。回転拡散は分子の大きさや周囲の粘度に関する直接的な情報を与えるため、分子間相互作用の解析に有用である。特に時間分解蛍光異方性法は、蛍光寿命（通常1〜5ナノ秒）の時間窓内で分子の配向変化を追跡できることから、創薬や低分子結合解析において高い処理能力と分子特異性を実現している。

　しかし、従来の時間分解蛍光異方性法では、観測可能な時間窓が蛍光寿命に制限されるため、約30キロダルトンを超える大型分子複合体の回転運動を検出できないという根本的な制約があった。ヒトの全タンパク質およびその複合体の大部分はこの質量範囲を超えており、従来手法では静止状態と区別できなかった。

　そこで、本研究ではSTARSS法を開発し、可逆光スイッチング蛍光タンパク質（rsEGFP2やDronpaM159T）の長寿命ON-OFF状態遷移を利用することで、観測時間窓をマイクロ秒からミリ秒領域まで拡張した。これにより検出可能な質量範囲は従来の約1000倍以上に拡大し、30〜100ナノメートル径のシリカビーズの回転拡散を明確に分離できた。生細胞内ではクロマチン繊維の柔軟性、HIV-1粒子の成熟状態、Arc蛋白質のオリゴマー形成を検出することに成功した。実験系にはCobolt社製の405 nmおよび488 nm変調連続波レーザーを用い、偏光制御による光選択と蛍光読み出しを実現した。

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超解像顕微鏡法で使用された405nmと488nmレーザー

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背景

　超解像顕微鏡は、光の回折限界を超えた空間的な詳細を得るために重要であり、近年、生命科学分野で急速に研究が進められている。従来の超解像顕微鏡技術として、座標ターゲットスイッチング技術がある。この技術は、発光分子の集団を空間的に限定し、顕微鏡の点広がり関数を効果的に縮小することで、高解像度の画像を得るものである。特に、RESOLFT（Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions）は、低光量でのライブセルイメージングに適していることから注目されている。RESOLFTでは、可逆的にスイッチ可能な蛍光タンパク質を使用し、低光量での超解像イメージングが可能であるため、生細胞の観察に適している。従来のMoNaLISAシステムは、50 × 50 μm²の視野で高い光学的断面形成能力を持ち、3次元でのタイムラプスイメージングが可能である。また、STEDやSMLMなど他の超解像技術と比較して、RESOLFTはより低い光量で動作するため、生細胞への負担が少ないという利点がある。

従来の問題点

　しかし、従来のMoNaLISAシステムの視野は50 × 50 μm²と限られており、広範囲のイメージングには限界があった。STED技術では、高い光量が必要であるため、並列化の度合いが制限され、視野が20 μm程度に限られている。また、SMLM技術では、長時間の記録が必要であり、ライブセルイメージングには適さない。

解決方法と結果

　そこで、本研究では、光効率の良い光学系を利用して、MoNaLISAシステムの視野を4倍以上に拡大し、100 × 130 μm²の視野を実現した。この新しい設定では、視野内の高解像度イメージングが可能となり、ライブセルのタイムラプスイメージングを30分間連続して行うことができた。具体的には、カスタム設計されたマイクロレンズと回折格子を使用して、照明領域を拡大し、レーザーの出力を最大限に活用することによって達成された。これにより、ポストシナプス密度タンパク質Homer1cの超解像イメージングが広視野で可能となり、神経細胞内の構造を詳細に観察することができた。また、Cobolt社製レーザー（405 nm、473 nm、488 nm）を使用し、それぞれの波長で効率的に光を照射することで、視野全体にわたる均一な解像度（43–81 nm）が得られた。これにより、従来の技術では困難だった広範囲での高解像度イメージングが実現し、細胞全体の構造解析やダイナミクスの観察が可能となった。

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論文で使用されたCoboltのレーザー発振器

　ゴルジ体は、タンパク質の修飾と輸送において重要な役割を果たすオルガネラである。特に、タンパク質のN-グリカン修飾は、タンパク質の機能と運命を決定するために重要である。このプロセスは、ゴルジ体内の特定の部位に局在する糖転移酵素によって行われる。これらの酵素は、シス、メディアル、トランスゴルジシスチルナエといったゴルジ体の異なる部分に分布しており、その位置に応じて異なる役割を果たす​​。従来の研究では、超解像顕微鏡技術を用いてこれらの酵素の詳細な分布を観察することが可能であり、ゴルジ体内の酵素分布の精密な解析が行われてきた。特に、3D超解像イメージングは、従来の光学顕微鏡では捉えきれないナノメートルスケールでの観察を可能にし、ゴルジ体の微細構造の理解に大きく貢献している​​。

　しかし、糖転移酵素の局在解析において、従来の技術では酵素間の共局在の定量的評価が困難であった。また、各酵素のサブゴルジ局在の微細な違いを十分に捉えることができず、酵素の分布パターンの詳細な理解が不十分であった​​。さらに、異なる酵素間の相互作用や分布のばらつきを正確に解析する手法が不足しており、酵素の局在メカニズムの解明には限界があった​​。

　そこで、本研究では3D超解像イメージングを用いて、糖転移酵素のサブゴルジ局在を詳細に解析した。具体的には、二色の蛍光タンパク質で標識した糖転移酵素を同時に観察し、その共局在度を定量化することで、酵素の分布パターンを高精度で解析した​​。さらに、糖転移酵素のN末端領域（細胞質領域、膜貫通領域、幹セグメント）を操作することで、これらの領域が酵素のサブゴルジ局在に与える影響を調査した​​。結果として、N末端領域を共有する酵素は高い共局在度を示し、この領域が酵素の局在を決定する重要な要因であることが明らかになった​​。
　実験にはCobolt社製レーザー（473 nm, 50 mW; 561 nm, 50 mW）およびCrystaLaser社製レーザー（671 nm, 100 mW）を用いた​​。これにより、ナノメートルスケールでの精密な蛍光イメージングが可能となり、各酵素の詳細な分布パターンを高精度で解析することができた。
　以上の結果から、本研究は糖転移酵素の局在メカニズムの理解に重要な知見を提供し、タンパク質の糖鎖修飾の精密な制御に向けた新たなアプローチを示した。これにより、臨床応用に向けた糖タンパク質の発現や修飾のプログラミングが進展することが期待される​​。

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超解像顕微鏡法で使用された473nmと561nmレーザー

　超解像顕微鏡は、生物フォトニクスの分野で3D生物構造の詳細を明らかにする技術として急速に研究が進められている。例えば、単分子局在イメージング技術である確率的光学再構成顕微鏡（STORM）や光活性化局在顕微鏡（PALM）、および刺激発光減衰顕微鏡（STED）などが、ナノメートル単位のイメージング解像度を達成している。しかし、これらの技術は低速のイメージング速度と光毒性の問題があり、長期間の大規模な高速超解像イメージングには制限がある。一方、構造化照明顕微鏡（SIM）は、より高い光子効率、イメージング速度、および低光毒性を持ち、適度な解像度向上を実現している。従来のSIMは、高周波情報を含む複数の位相シフト構造画像を生成し、干渉を通じて異なる方向から取得することで超解像画像を再構成する。これにより、厚いまたは密な生物試料における高背景信号やノイズの問題を解決するための技術が進化してきた。

　しかし、従来のSIMでは、TIRF-SIMやGI-SIMのような技術が使用されるが、これらは表面に限定された照明を利用しており、イメージング深度に制約がある。また、LiMoやHiLoアルゴリズムのような背景除去方法も有望な結果を示しているが、解像度は回折限界に制約される。さらに、従来のスキャニング顕微鏡(ISM)はシリアルスキャン構成（例えば、ガルバノミラーを使用）であり、低速なイメージング速度に悩まされている。これを解決するために、デジタルマイクロミラーデバイスやスピニングディスクを利用した並列スキャンISMが開発されたが、計算の複雑さが増し、複数の中心位置を特定する必要があるため、リアルタイム処理が困難になる問題がある。

　そこで、本研究では、ピクセル再割り当てラインスキャン顕微鏡（PRLM）を提案し、大規模な3D超解像イメージングを実現した。記録されたライン画像を各スキャン位置のライン照明中心に再割り当てして解像度を向上させ、次にHiLoアルゴリズムを適用して背景信号を除去する。この簡単な設計により、PRLMは密度の高い厚い生物試料の超解像イメージングに適した容易でコンパクトな低コストのソリューションとなる。
　シミュレーションと実験の結果、PRLMは0.41 µmの解像度と3400ピクセル/ミリ秒のイメージング速度を達成した。シミュレーションと実験により、蛍光ビーズのPSFが評価され、U-2 OS細胞や花粉粒などの生物試料の3Dイメージング能力が実証された。これらの結果は、PRLMが大規模生物試料の超解像可視化に適した強力なツールであることを確認した。

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超解像顕微鏡法に使用された491nmレーザー

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Hong, H., Guo, S., Jin, L., Mao, Y., Chen, Y., Gu, J., Chen, S., Huang, X., Guan, Y., Li, X., Li, Y., Lü, X., Fu, Y. “Two-dimensional lead halide perovskite lateral homojunctions enabled by phase pinning.” Nature Communications 2024, 15, 3164. https://doi.org/10.1038/s41467-024-47406-1

　生きた細胞内の細胞小器官や巨大分子複合体の動態を観察するために、蛍光ナノスコピー（超解像顕微鏡法）の開発が急速に進められている 。超解像顕微鏡とは、光の回折という物理的制約によって制限されていた従来の光学顕微鏡の解像度（約200nm）を大幅に超え、数十ナノメートル単位の極めて高い空間分解能を実現する技術である 。この手法は、分子の蛍光状態を決定論的または確率的に光学制御することに基づき、10〜50 nmの解像度を達成している 。特に、可逆的飽和光蛍光遷移（RESOLFT）法は、可逆的スイッチング蛍光タンパク質（rsFPs）を活用することで、従来の超解像技術と比較して格段に低い光強度での撮像を可能にしている 。rsFPsとは、特定の波長の光照射により、蛍光を発するオン状態と発しないオフ状態を可逆的に切り替えられる特殊なタンパク質である 。この低光強度特性は、生体試料への光毒性や退色を抑えつつ、微細な構造を長時間にわたって観察できる利点を持つ 。また、広視野RESOLFT法を実装することで、広範囲の視野を高速に取得し、生命現象の動態を包括的に捉えることが可能となる 。これらの進歩により、細胞全体の3次元構造を時間軸とともに可視化する4次元イメージングの実現が期待されている 。

　しかし、従来の蛍光ナノスコピーは、強力な照明光による試料損傷、画像コントラストの欠如、視野の狭さ、あるいは記録速度の限界といった課題を抱えている 。広視野RESOLFT法においては、広域照明によって焦点外の平面からも不要な背景光が生じ、3次元試料における画像コントラストが著しく低下する 。また、並列化された発光点同士が近接しすぎることで信号の混信（クロストーク）が発生し、これを排除するために検出器のピンホールを絞りすぎると、光子収集効率が低下して信号対雑音比が悪化するという難点がある 。

　そこで、本研究では個別に最適化された3つの光パターンを組み合わせたMoNaLISA（Molecular Nanoscale Live Imaging with Sectioning Ability）を開発することによって、高い光子収集効率と優れた光学的切片化能力を両立し、これらの問題を解決した 。MoNaLISAは、蛍光タンパク質のオン切り替えと読み出しに大きな周期の多焦点パターンを用い、オフ切り替えには微細な周期の定在波パターンを採用することで、信号の混信を最小限に抑えつつ、検出できる光子量を最大化した 。撮像の際には、蛍光タンパク質の状態を精密に制御するための光源として、Cobolt社製の405 nmおよび488 nmのレーザーが用いられた 。これにより、生細胞内において45〜65 nmの空間分解能で長時間の4次元撮像を達成した 。

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論文で使用されたCoboltのレーザー

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