減数分裂において相同染色体の対合・組換え・分離を司るシナプトネマ複合体（SC）は、有性生殖に不可欠な多タンパク質複合体であり、その分子構造の解明は重要な研究課題である。SCは二本の側方要素、中央要素、および両者を連結する横糸フィラメントからなる梯子状の保存された構造を有する。従来、このような多タンパク質複合体の微細構造の解析には電子顕微鏡が必要であった。試料を膨潤性含水ゲルに包埋して物理的に膨張させることで、通常の蛍光顕微鏡でも回折限界を迂回できる膨張顕微鏡法（ExM）が開発され、約70 nmの横方向分解能での観察が可能となっている。

　しかし、高倍率の膨張は標識密度を著しく低下させ、構造分解能の劣化を招く問題があった。加えて、三次元的な等方的膨張や多タンパク質複合体の超微細構造が忠実に保存されるかについても疑問が残されていた。さらに、超解像顕微鏡法の一つであるdSTORMは高い空間分解能を提供するものの、光スイッチング緩衝液の最適化が必要なため同時に二色までの観察に制限されていた。

　そこで、本研究ではタンパク質膨張解析法（MAP）と構造化照明顕微鏡法（SIM）を組み合わせたMAP-SIM法を開発し、マウス精母細胞のSCを20〜30 nmの空間分解能で三色同時超解像観察することに成功した。MAP法は約4.2倍の等方的膨張と分子構造の保存を達成し、膨張後に免疫標識を行うことで従来到達できなかった抗原部位への標識効率の向上と連結誤差の低減を実現した。その結果、SC中央領域のタンパク質が単純な層状構造ではなく複雑な網目状構造を形成していること、また側方要素が二本以上の副側方要素に分岐する様子を光学顕微鏡で初めて可視化した。大視野三次元撮像に用いた再走査型共焦点顕微鏡にはCobolt社製Skyra多波長光源（405、488、561、640 nm）が励起光源として使用された。

【用語解説】

dSTORM：有機蛍光色素の確率的な光スイッチング現象を利用して個々の分子の位置を逐次的に決定し、回折限界以下の分解能で画像を再構築する超解像顕微鏡法の一種である。

シナプトネマ複合体（SC）：減数分裂の前期Iにおいて相同染色体間に形成されるタンパク質構造体。染色体の対合と遺伝的組換えの場を提供し、正常な配偶子形成に必須である。

膨張顕微鏡法（ExM）：試料を膨潤性含水ゲルに包埋し、物理的に数倍に膨張させることで、通常の蛍光顕微鏡でも回折限界を迂回した高分解能観察を可能にする手法である。

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実験に使用されたCobolt Skyra

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　細胞間の直接的な物質輸送経路として機能する膜状の突起構造であるトンネルナノチューブ（TNT）は、小分子やミトコンドリア等の細胞小器官、さらには細菌やウイルスの細胞間移送に関与することから、近年急速に研究が進められている。ヒト免疫細胞やゼブラフィッシュ胚においてTNTの形成が報告されているが、魚類の皮膚上皮細胞（角化細胞）における報告はなされていなかった。TNTは高さ100 nm以下に達する極めて微細な構造であり、その形態や動態の定量的解析には高感度な顕微計測技術が不可欠である。試料に対して非侵襲・無標識で光路長差から位相情報を取得する定量位相顕微鏡法（QPM）は、生細胞の体積、乾燥質量、厚さ変動等の形態・生物物理学的指標を精密に定量できる手法であり、生細胞観察との親和性が高い。

　しかし、完全コヒーレントな光源を用いたQPMではスペックル雑音や寄生縞が発生し、空間位相感度が低下するという問題がある。一方、ハロゲンランプやLED等の低コヒーレンス光源は高い位相感度を実現できるものの、時間的コヒーレンス長が短いため干渉縞の形成が困難である。また、蛍光標識を用いた観察法では光褪色や光毒性が生じ、TNTのような力学的に脆弱な構造の長時間観察に適さない。

　そこで、本研究ではCobolt社製532 nmレーザー（Cobolt Samba）を回転拡散板に照射して擬似熱光源を生成し、低空間コヒーレンス・高時間コヒーレンスを両立させたQPM系を構築することで上記の課題を解決した。5枚の位相シフト干渉像から主成分分析に基づく位相復元を行い、空間位相感度2.9 mrad（高さ換算2.4 nm）を達成した。サケ角化細胞のTNTを無標識・実時間で観測した結果、TNTの高さは約100〜900 nmの範囲にあり、高さと幅の比が1未満であることから、断面形状は円筒形ではなく扁平であることが示された。時間分解観測では、観察期間を通じて構造を維持するTNTと破断するTNTの双方が確認され、破断は緩やかな高さ減少ではなく突発的に生じることが明らかとなった。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいており、査読前論文です。

使用された532 nmレーザー

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　生細胞の代謝を非侵襲的に観察する手法として、分子の振動エネルギー準位遷移を利用した振動分光顕微鏡が近年注目されている。この手法は、蛍光標識を必要とせず、脂質・タンパク質・糖質といった生体分子を固有の化学コントラストで識別できる点で非常に有用である。とりわけ、各画素が幅広い振動スペクトル情報を持つハイパースペクトル画像を取得できれば、生細胞の代謝状態を定量的かつ網羅的に解析することが可能となる。また、多数の細胞を同一視野で観察するためには広い撮像視野（FOV）が不可欠であり、細胞が高密度に充填された状態（コンフルエント状態）での計測は、細胞が生体内に近い環境で示す分化挙動などの生理的現象を正確に捉えるために重要である。
　中赤外（mid-IR）光の吸収断面積はラマン散乱の約10億倍に達することから、光熱効果と光学的位相コントラスト検出を組み合わせた広視野mid-IR顕微法は、高速な超分光撮像を実現する有力な手段として期待されている。

　しかし、従来の広視野光熱顕微鏡には大きな問題点がある。mid-IR吸収によって生じる微小な位相変化（MIR位相）は、試料固有の屈折率に起因する背景位相（固有位相）より2〜3桁も小さく、これをHilbert変換や非線形位相アンラッピングといった後処理で除去しようとすると、弱いMIR位相信号が改変されて検出感度が著しく低下する。さらに、高密度なコンフルエント細胞では固有位相の位相折り返しが顕著となり、従来の定量的位相顕微法では正確な画像取得が困難であった。加えて、先行手法（BSTP・MV-QPI）は高速撮像を実現するものの、撮像視野が10〜50 µmと極めて狭く、細胞集団の統計的解析に必要な100 µm以上のFOVを達成できていなかった。

　そこで、本研究では偏光を利用した位相シフト機構（PSM）を組み込んだ位相シフト光熱顕微鏡（PSOM）を開発することによって、上記の問題点を解決した。PSOMは試料の固有位相を光学的に相殺しながらMIR位相のみを抽出するため、後処理を必要とせず、雑音等価位相を0.26 mradと最先端比で4分の1に低減することに成功した。その結果、最大5.18×10⁵ µm²という従来比50倍の撮像視野でのハイパースペクトル撮像と、細胞密度100%のコンフルエント状態にある生細胞の中赤外イメージングを世界で初めて実現した。さらに、照射強度は従来の振動顕微法（CARS等）と比較して4桁低く抑えられ、細胞生存率85.4%（2時間照射後）という高い安全性も確認された。なお、本研究では532 nmパルスレーザー（Cobolt 06-Tor、繰り返し周波数2 kHz）をプローブ光として使用し、mid-IRポンプ光によって誘起される光熱的位相変化を偏光干渉計で検出するための参照・試料ビームの光源として機能させた。

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使用された532nmパルスレーザー

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　光学顕微鏡は生命科学において細胞構造や動態を可視化するために不可欠な技術であり、近年さらなる高空間・高時間分解能化が進められている。蛍光顕微鏡は回折限界を超える超解像技術として発展してきたが、生細胞観察では光毒性や標識効率、生体機能への擾乱が課題となる。一方、試料からの散乱光を参照光と干渉させて検出する干渉散乱顕微鏡（iSCAT）は、蛍光色素や遺伝子タグを必要とせず、単一蛋白質やウイルスを高感度で検出できる無標識技術として注目されている。また、アレイ検出器を用いて閉ピンホールの分解能と開ピンホールの信号雑音比を両立させる画像走査顕微鏡（ISM）も、共焦点顕微鏡の性能を向上させる手法として確立されている。

　しかし、従来の共焦点iSCATでは、閉ピンホール設定で高分解能を得ようとすると検出光子数が大幅に減少し、信号雑音比が低下するという問題がある。また、生細胞内部の不均一な媒質ではコヒーレント光による散乱の重畳がスペックルを生じ、像質が劣化する。さらに、従来手法では入射照明強度が比較的高く、長時間観察時の光損傷が懸念されていた。

　そこで、本研究ではiSCATとISMの概念を統合した干渉性画像走査顕微鏡（iISM）を開発し、これらの問題を解決した。干渉点広がり関数の位相情報を考慮した適応的画素再配置法を導入することで、約120 nmの横方向分解能と従来比約4倍の対比雑音比を達成した。Cobolt社製445 nm半導体レーザーを照明光源として使用し、回折限界スポット当たり約0.5 μWの低入射強度で小胞体、ミトコンドリア、小胞などの細胞内小器官を長時間にわたり撮像することに成功した。

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フォトルミネッセンスに使用された445nmレーザー

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　ヒトの皮膚における老化過程や、乾癬、強皮症といった様々な病態を詳細に研究する上で、皮膚の生体力学的特性を測定することは極めて重要である 。皮膚の弾力性を調査することは、組織疾患の評価のみならず、化粧品などの有効性を判断する上でも有用な指標となる 。光子と音響量子であるフォノンの散乱相互作用を利用して非接触かつ無標識で試料の粘弾性を評価する手法であるブリュアン分光法は、外部から機械的な変形を加えることなく、ミクロン単位の空間分解能で局所的な縦弾性係数を取得できる有望な技術である 。特に長波長の光源を用いることで、皮膚深部の真皮層まで光を到達させ、深度に応じた弾性プロファイルを構築することが可能となる 。

　しかし、従来の吸引法や圧痕法、あるいは超音波を用いた手法では空間分解能に限界があり、表皮のような非常に薄い層を個別に解像して測定することが困難である 。また、光干渉断層撮影法を応用して弾性を評価する手法では、皮膚に対して物理的な応力を加える必要があるという課題がある 。さらに、従来のブリュアン顕微鏡を用いた研究は主に体外での測定に限定されており、生体内での測定においては呼吸や心拍に伴う不可避な検体の動きが原因で、測定位置の正確な深度を特定できず、精緻な弾性写像が得られないという重大な問題点がある 。

　そこで、本研究ではブリュアン顕微鏡と、近赤外光の干渉を利用して組織内部の断層画像を取得する技術である光干渉断層撮影法（OCT）を組み合わせることにより、検体の動きを補正した深度分解型の生体力学測定を実現し、問題を解決した 。ブリュアン顕微鏡の光源には、Cobolt社製の波長660 nmのCWレーザーを使用し、試料から散乱された光を収集して分光計へ導くことでブリュアン偏移を計測した 。OCTを用いて皮膚表面の位置を高速に追跡することで、動きによる誤差を排除し、計測されたブリュアン偏移を正確な深度に対応付けることに成功した 。手首での測定の結果、表皮において7 GHz付近と9から10 GHz付近の二つの山が確認され、後者は角質層における角質化した細胞の硬さに起因すると考えられる 。一方で真皮のブリュアン偏移は6.8 GHzと低く、表皮よりも剛性が低いことが示された 。本手法は、将来的に皮膚疾患が弾性特性に与える影響を非侵襲的に調査するための強力な道具となる 。

※本要約は、Optica Open Access Publishing Agreement に基づき、作成・公開されています。

論文で使用されたCoboltのレーザー

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　近年、脳の活動をマクロからミクロまで理解することが神経科学において重要であるとされている。特に、脳の構造は非常に複雑であり、局所的な神経活動を把握することと、脳全体の活動を把握することは別々の技術を必要とする。そのため、従来技術としてマクロスケールの技術（例えば、fMRI）とミクロスケールの技術（例えば、多光子カルシウムイメージングやマルチ電極記録）が開発され、脳活動の理解が進められてきた。
　fMRIなどのマクロスケールイメージング技術により、脳全体の機能的ネットワークや各領域の役割を把握することが可能である一方、多光子カルシウムイメージングなどは個々の細胞レベルでの活動を詳細に観察することができる。これにより、局所的な脳回路の高い多様性や、近隣の細胞間での異なる機能的特性を明らかにすることができた。さらに、光シート顕微鏡はゼブラフィッシュ幼虫などの透明なサンプルに対して有用で、深部組織の高速ボリュームイメージングを可能にしている。このように、従来の技術は、脳の各スケールに対応した詳細なデータを取得するために非常に有効であった。

　しかし、従来のマクロスケールおよびミクロスケールの技術では、それぞれの観測領域が限られており、全脳レベルでかつ細胞分解能で脳活動を同時に観察することは難しかった。また、fMRIは複数の細胞の平均的な活動を一つの値として表現するため、個々の細胞の活動を正確に把握することができず、多光子顕微鏡では観測可能な視野が限られているため、全脳活動の全体像を把握することが困難であった。さらに、脳のサイズや不透明性によっては、光シート顕微鏡を適用することも制限があった。このような技術的制約のため、脳の全体的な活動と局所的な細胞活動の関係を統一的に理解することは、依然として大きな挑戦となっていた。

　そこで、本研究では、従来の技術の制約を克服するために「ブレイズド斜平面顕微鏡（Blazed Oblique Plane Microscopy, BOPM）」を開発した。この技術により、脳全体の細胞分解能での神経活動を同時に記録することが可能となった。BOPMでは、サンプル内の斜めの平面を励起し、同一の対物レンズを使用して蛍光を収集することで、広い視野と高い分解能を両立することができた。また、光ファイバーを用いたフェースプレートを組み合わせることで、斜平面を効率的に再イメージングする手法を取り入れた。
　この技術を用いて、成体のDanionella cerebrum（透明な脳を持つ小型魚類）の脳全体の活動を記録し、スケール不変の神経活動の予測を行うことに成功した。実験結果から、局所的な細胞活動とマクロスケールのボクセル活動の間に強い相関が見られ、両者が類似した予測能力を持つことが示された。この結果は、従来のマクロスケール技術が必ずしもミクロスケール技術に劣っているわけではなく、それぞれのスケールが脳全体の活動を予測するために有効であることを示している。また、この技術を用いることで、脳全体の細胞活動を記録しながら、その活動の時間的および空間的相関を評価することが可能となり、脳の動的なネットワーク構造の理解が進展することが期待される。
　Cobolt社の488 nmレーザーは、励起光源として使用され、光シートを形成するために用いられた。このレーザーは高速の蛍光記録を可能にし、脳内での広範囲にわたる神経活動の観測をサポートした。また、CNI製の532 nmレーザーもシステムに組み込まれており、光ファイバーを介してシステム内に結合されて、光伝達効率を最適化するために利用されている。この532 nmレーザーは、ブレイズド斜平面顕微鏡の光学的なコリメーションと中間イメージングに重要な役割を果たしている。

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論文で使用されたCoboltの488nmレーザー

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　従来の振動分光ベースの顕微鏡技術は、細胞や組織の分子の振動遷移を利用することで、ラベル不要で化学的構造や分子組成に基づくコントラストを得ることができる。その中でも、コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）や刺激ラマン散乱（SRS）、中赤外（Mid-IR）顕微鏡は、細胞や組織に対する非侵襲的なラベルフリーのイメージングを可能にし、生体内の化学的な情報を高解像度で捉えることができるため、近年急速に研究が進められている。特に、ハイパースペクトル画像を取得することで、異なる脂質やタンパク質、糖質などの生体分子群を識別することが可能となり、これにより細胞の代謝過程を外部の蛍光標識を使用せずに観察することができる。
　BSTP（Bond-Selective Transient Phase Imaging）やMV-QPI（Molecular Vibration-Sensitive Quantitative Phase Imaging）など、広視野での中赤外光熱効果を利用した高速なハイパースペクトルイメージング技術が開発され、24フレーム/秒を超えるビデオレートでのラベルフリー中赤外イメージングを実現している。また、これらの技術は、広視野での光熱効果を利用することで、高速かつ高感度な分子コントラストの取得が可能である。このような背景から、振動分光顕微鏡技術は、生体内の化学的変化を迅速に捉えるために重要な役割を果たしている。

　しかし、これまでの振動分光イメージング技術では、高コンフルエンスの細胞集団を大きな視野で高速に撮影することが難しかった。例えば、BSTPやMV-QPIでは、高速なラベルフリーの中赤外ハイパースペクトルイメージングを実現しているものの、その視野は10〜50 μmに制限されており、大規模な細胞集団を捉えることができない。また、中赤外ハイパースペクトルイメージングにおいては、従来の機械的走査により長時間の露光が必要であり、これが細胞への光損傷のリスクを増加させる問題があった。さらに、広視野のフォーリエ変換赤外（FTIR）顕微鏡も開発されているが、これは主に乾燥した薄い組織片に使用されており、生きた細胞に対しては適用が困難である。これらの技術は、特に広視野での高感度なイメージングが求められる状況において、その限界が明らかであった。

　そこで、本研究では、フェーズシフト光熱顕微鏡（PSOM）を用いて、高コンフルエンスの細胞集団に対する中赤外ハイパースペクトルイメージングを実現した。PSOMは、広視野励起と偏光ベースのフェーズシフトモジュールを組み合わせることにより、サンプルの大きな固有位相を抑制し、高感度な化学コントラストイメージングを可能にする。この技術により、既存の光熱顕微鏡技術の50倍に達する視野でライブセルの中赤外イメージングを行い、さらに、従来の振動イメージングモダリティで使用される励起パワーフラックス密度（PFD）の1万分の1まで減少させることに成功した。これにより、細胞への光損傷リスクを大幅に低減しつつ、高感度なラベルフリーイメージングを実現している。
　PSOMを用いた実験では、成熟した脂肪細胞の脂質滴（LD）の高コンフルエンス下でのイメージングが行われ、従来の技術では観察困難であった大規模な細胞集団に対する定量的な解析が可能であることが示された。さらに、Cobolt社製の532 nmのパルスレーザー（Cobolt Tor）が、サンプル面での偏光状態の変化を読み取るためのプローブビームとして使用されており、光熱効果による分子コントラストの高感度な検出に寄与している。このレーザーは、低パワーでの高感度測定を実現するための重要な要素であり、フェーズシフト光熱顕微鏡の性能向上に大きく貢献している。

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光熱顕微鏡に使用された532nmパルスレーザー

　ウイルス感染症の診断には、ウイルスの構成成分であるタンパク質や核酸を特定することが不可欠である。特に、核酸や表面タンパク質を標的とした従来の診断法は、ウイルス感染の早期発見に重要な役割を果たしてきた。これらの方法は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅技術や抗原検出を活用し、高精度なウイルス検出を可能にしている。さらに、ラベルフリー技術の進展により、ウイルスの光学的特性や形態の特徴を解析することが可能となり、特に干渉法を利用したイメージング技術がウイルスの検出と追跡に有効であることが示されている。
　中赤外フォトサーマル（MIP）顕微鏡は、赤外光の吸収を利用して化学的選択性を持つイメージングを行う技術であり、広くバイオマテリアルの解析に使用されてきた。MIPは可視光の回折限界を超えた解像度を持ち、細胞や細菌、ウイルスといった微細構造の化学的情報を取得することができる。この技術は、従来の赤外吸収法やラマン散乱法と比べてはるかに高い感度とスループットを持つため、ウイルス構造の詳細な化学成分を分析する上で大きな長所がある。

　しかし、従来のMIP顕微鏡はスキャン方式に依存しているため、取得に長い時間がかかり、スループットが低い問題があった。また、単一のウイルス粒子の化学的解析を行うには十分な感度を確保することが難しく、広視野でのウイルス検出や正確なスペクトル解析には課題が残されていた。さらに、ウイルスの化学的内容物を分析するには、従来の光学干渉法では分子情報の取得が不十分であった。

　そこで、本研究では、広視野干渉法を強化した中赤外フォトサーマル顕微鏡（WIDE-MIP）を開発し、単一ウイルスの高スループット指紋解析を実現した。この技術では、干渉によって散乱光の信号を強化し、さらに焦点位置を調整することでMIPコントラストを大幅に向上させた。これにより、従来のスキャン方式のMIPに比べて3桁のスループット向上を達成し、100nmサイズのポリメチルメタクリレート（PMMA）粒子の検出に成功した。
　実験では、単一のワクシニアウイルス（VACV）およびベシキュラーストマチチスウイルス（VSV）の指紋スペクトルを取得し、ウイルスタンパク質と核酸の化学的特徴を特定することができた。特に、DNAウイルスとRNAウイルスの核酸の違いを反映するサイミンおよびウラシルの残基振動を検出し、これらのウイルスの化学指紋を明確に識別した。また、広視野MIPは、ウイルスのタンパク質二次構造のβシート成分が豊富であることも示した。また、Cobolt社のレーザー（波長488 nm）は、蛍光イメージングのための励起光源として使用された。

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　近年、ナノ構造物や分子の詳細な化学的構造を明らかにするために、フォトサーマル顕微鏡技術が急速に発展している。これは、局所的な熱勾配を光学的に検出することで高感度の化学イメージングを可能にする手法である。特に、可視光フォトサーマル顕微鏡や中赤外フォトサーマル顕微鏡がこれまでに開発されてきた。可視光フォトサーマル顕微鏡は、金ナノ構造の場増強効果を利用し、単一の光吸収性ナノ粒子をターゲットにしたイメージングに優れており、非蛍光色素分子や半導体ナノ結晶の検出に成功している。一方、中赤外フォトサーマル顕微鏡は、化学情報が豊富な「フィンガープリント領域」を利用することで、物質や生命科学において多くの応用がなされている。例えば、単一金属ナノワイヤのファブリ・ペロー共振モードのマッピングや、ペロブスカイトの局所的なカチオン不均一性の解明などが挙げられる。さらに、細菌の代謝応答や細胞・組織内のタンパク質の構造マッピング、そして中赤外報告子を用いた酵素活性のマッピングなど、生命科学の分野でも重要な成果を上げている。これらの技術は、ナノスケールでの詳細な化学構造の解明において、重要な役割を果たしている。

　しかし、可視光フォトサーマル顕微鏡は化学的特異性が乏しく、中赤外フォトサーマル顕微鏡は水の強い吸収による光の減衰が大きく、厚い組織のイメージングには適していない。特に、中赤外領域では水の吸収が強いため、組織内部の光減衰が顕著であり、測定時のバックグラウンドノイズが増大し、精度が低下する。また、従来の中赤外フォトサーマル顕微鏡は、光学的制約により高NA（開口数）対物レンズの使用が困難であり、その結果、解像度が低下する問題もある。

　そこで、本研究では、短波赤外（SWIR）領域での励起と可視光プローブを組み合わせた「オーバートーンフォトサーマル（OPT）顕微鏡」技術を提案し、これにより高い解像度と高い感度を同時に実現した。この技術は、C-H伸縮振動の2次オーバートーン領域でサンプルを励起し、局所的な熱レンズ効果を可視光で検出することで、化学特異性を高めながらも水の吸収による光減衰を避けることができる。実験では、SWIR波長をチューニングし、光走査により化学マッピングを行い、ポリマー構造や生細胞内のタンパク質および脂肪酸の深さ分解能を持つイメージングに成功した。さらに、マルチスケールの構造と化学組成の調査を可能にする大規模短波赤外イメージング技術との組み合わせにより、生物学的および材料科学の分野において有用な知見を提供することが期待される。

また、このOPT顕微鏡では、Cobolt社製の532 nmの連続波レーザー（Samba 532 nm）をプローブビームとして使用し、局所的な温度変化を検出することで、高い空間解像度と感度を実現している。このレーザーの使用により、信号のノイズレベルが大幅に低減され、精密な化学イメージングが可能となった。

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フォトサーマル顕微鏡で使用された532nmレーザー

　繊毛はほとんどの真核細胞に突き出た感覚器官であり、外部の信号を細胞体に伝える役割を果たしている。そのため、繊毛の正常な機能は細胞の正常な動作にとって非常に重要である。繊毛内部には細胞体とは異なる特定のタンパク質のプールが必要であり、この異なる組成を維持するために、真核細胞は特殊な細胞内輸送システムである**繊毛内輸送（IFT）**を使用している。IFTは、主にIFT-BおよびIFT-A複合体からなる大規模なポリマー構造であり、これらの複合体が規則的に繰り返されることで形成される。IFTトレインは、繊毛基底部で組み立てられ、キネシン-2モーターによって駆動されることで、繊毛基底部から移行領域（TZ）を経て繊毛の先端まで輸送される。C. elegansにおいては、順行性IFTは、ヘテロ三量体キネシン-IIとホモ二量体OSM-3の2つのキネシン-2モーターによって駆動される。キネシン-IIは移行領域を越える際に順行性IFTトレインをナビゲートし、その後徐々に速いOSM-3に置き換えられて、繊毛の先端まで輸送される。従来の研究では、蛍光回復法（FRAP）や構造解析により、繊毛基底部で順行性IFTトレインが段階的に組み立てられることが示されている。IFT-B複合体がテンプレートとして機能し、IFT-A、IFT-ダイニン複合体、およびキネシン-IIが順次結合することでトレインが形成される。さらに、いくつかの繊毛膜タンパク質が順行性IFTトレインに結合して移行領域を越えることが示されている。

　しかし、順行性IFTトレインがどのようにして繊毛基底部で組み立てられ、どのようにしてタンパク質がこれに結合するかはまだ完全には理解されていない。また、繊毛基底部でのIFTトレインの動態や、異なる繊毛タンパク質がどのようにしてIFTトレインと結合して移行領域をナビゲートするかについての理解も不十分である。

　そこで、本研究ではC. elegansの化学感覚ニューロンの繊毛をモデルシステムとして使用し、単一分子イメージングを用いて、キネシン-II、OSM-3、およびIFT-ダイニンモーターとチューブリンが繊毛にどのように入るかを直接観察した。**小窓照明顕微鏡法（SWIM）**を使用して、PHA/PHBニューロンペアの繊毛におけるこれらのタンパク質のエントリーを可視化し、単一粒子追跡を行った。これにより、IFT成分が時間的および空間的に順次トレインに結合することが示された。また、野生型および変異体の線虫におけるIFT成分の超解像マッピングを行い、キネシン-IIが軸糸の組織化に不可欠であることを明らかにした。特に、キネシン-IIおよび/または移行領域機能を欠く繊毛のイメージングにより、キネシン-IIとOSM-3の相互作用がIFTトレインを効率的に移行領域を越えて運ぶ上で重要な役割を果たしていることが示された。本研究では、Cobolt社製レーザーを用いて、SWIM法による単一分子イメージングのための蛍光励起および漂白に使用した。Cobolt社製のレーザー発振器は高いレーザー強度を提供し、長時間にわたり高信号対背景比の単一分子イベントのイメージングを可能にする。

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論文で使用されたCoboltの561nmレーザー

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