生細胞の代謝を非侵襲的に観察する手法として、分子の振動エネルギー準位遷移を利用した振動分光顕微鏡が近年注目されている。この手法は、蛍光標識を必要とせず、脂質・タンパク質・糖質といった生体分子を固有の化学コントラストで識別できる点で非常に有用である。とりわけ、各画素が幅広い振動スペクトル情報を持つハイパースペクトル画像を取得できれば、生細胞の代謝状態を定量的かつ網羅的に解析することが可能となる。また、多数の細胞を同一視野で観察するためには広い撮像視野（FOV）が不可欠であり、細胞が高密度に充填された状態（コンフルエント状態）での計測は、細胞が生体内に近い環境で示す分化挙動などの生理的現象を正確に捉えるために重要である。
　中赤外（mid-IR）光の吸収断面積はラマン散乱の約10億倍に達することから、光熱効果と光学的位相コントラスト検出を組み合わせた広視野mid-IR顕微法は、高速な超分光撮像を実現する有力な手段として期待されている。

　しかし、従来の広視野光熱顕微鏡には大きな問題点がある。mid-IR吸収によって生じる微小な位相変化（MIR位相）は、試料固有の屈折率に起因する背景位相（固有位相）より2〜3桁も小さく、これをHilbert変換や非線形位相アンラッピングといった後処理で除去しようとすると、弱いMIR位相信号が改変されて検出感度が著しく低下する。さらに、高密度なコンフルエント細胞では固有位相の位相折り返しが顕著となり、従来の定量的位相顕微法では正確な画像取得が困難であった。加えて、先行手法（BSTP・MV-QPI）は高速撮像を実現するものの、撮像視野が10〜50 µmと極めて狭く、細胞集団の統計的解析に必要な100 µm以上のFOVを達成できていなかった。

　そこで、本研究では偏光を利用した位相シフト機構（PSM）を組み込んだ位相シフト光熱顕微鏡（PSOM）を開発することによって、上記の問題点を解決した。PSOMは試料の固有位相を光学的に相殺しながらMIR位相のみを抽出するため、後処理を必要とせず、雑音等価位相を0.26 mradと最先端比で4分の1に低減することに成功した。その結果、最大5.18×10⁵ µm²という従来比50倍の撮像視野でのハイパースペクトル撮像と、細胞密度100%のコンフルエント状態にある生細胞の中赤外イメージングを世界で初めて実現した。さらに、照射強度は従来の振動顕微法（CARS等）と比較して4桁低く抑えられ、細胞生存率85.4%（2時間照射後）という高い安全性も確認された。なお、本研究では532 nmパルスレーザー（Cobolt 06-Tor、繰り返し周波数2 kHz）をプローブ光として使用し、mid-IRポンプ光によって誘起される光熱的位相変化を偏光干渉計で検出するための参照・試料ビームの光源として機能させた。

※本要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

使用された532nmパルスレーザー

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　光学顕微鏡は生命科学において細胞構造や動態を可視化するために不可欠な技術であり、近年さらなる高空間・高時間分解能化が進められている。蛍光顕微鏡は回折限界を超える超解像技術として発展してきたが、生細胞観察では光毒性や標識効率、生体機能への擾乱が課題となる。一方、試料からの散乱光を参照光と干渉させて検出する干渉散乱顕微鏡（iSCAT）は、蛍光色素や遺伝子タグを必要とせず、単一蛋白質やウイルスを高感度で検出できる無標識技術として注目されている。また、アレイ検出器を用いて閉ピンホールの分解能と開ピンホールの信号雑音比を両立させる画像走査顕微鏡（ISM）も、共焦点顕微鏡の性能を向上させる手法として確立されている。

　しかし、従来の共焦点iSCATでは、閉ピンホール設定で高分解能を得ようとすると検出光子数が大幅に減少し、信号雑音比が低下するという問題がある。また、生細胞内部の不均一な媒質ではコヒーレント光による散乱の重畳がスペックルを生じ、像質が劣化する。さらに、従来手法では入射照明強度が比較的高く、長時間観察時の光損傷が懸念されていた。

　そこで、本研究ではiSCATとISMの概念を統合した干渉性画像走査顕微鏡（iISM）を開発し、これらの問題を解決した。干渉点広がり関数の位相情報を考慮した適応的画素再配置法を導入することで、約120 nmの横方向分解能と従来比約4倍の対比雑音比を達成した。Cobolt社製445 nm半導体レーザーを照明光源として使用し、回折限界スポット当たり約0.5 μWの低入射強度で小胞体、ミトコンドリア、小胞などの細胞内小器官を長時間にわたり撮像することに成功した。

※本要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

フォトルミネッセンスに使用された445nmレーザー

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　ヒトの皮膚における老化過程や、乾癬、強皮症といった様々な病態を詳細に研究する上で、皮膚の生体力学的特性を測定することは極めて重要である 。皮膚の弾力性を調査することは、組織疾患の評価のみならず、化粧品などの有効性を判断する上でも有用な指標となる 。光子と音響量子であるフォノンの散乱相互作用を利用して非接触かつ無標識で試料の粘弾性を評価する手法であるブリュアン分光法は、外部から機械的な変形を加えることなく、ミクロン単位の空間分解能で局所的な縦弾性係数を取得できる有望な技術である 。特に長波長の光源を用いることで、皮膚深部の真皮層まで光を到達させ、深度に応じた弾性プロファイルを構築することが可能となる 。

　しかし、従来の吸引法や圧痕法、あるいは超音波を用いた手法では空間分解能に限界があり、表皮のような非常に薄い層を個別に解像して測定することが困難である 。また、光干渉断層撮影法を応用して弾性を評価する手法では、皮膚に対して物理的な応力を加える必要があるという課題がある 。さらに、従来のブリュアン顕微鏡を用いた研究は主に体外での測定に限定されており、生体内での測定においては呼吸や心拍に伴う不可避な検体の動きが原因で、測定位置の正確な深度を特定できず、精緻な弾性写像が得られないという重大な問題点がある 。

　そこで、本研究ではブリュアン顕微鏡と、近赤外光の干渉を利用して組織内部の断層画像を取得する技術である光干渉断層撮影法（OCT）を組み合わせることにより、検体の動きを補正した深度分解型の生体力学測定を実現し、問題を解決した 。ブリュアン顕微鏡の光源には、Cobolt社製の波長660 nmのCWレーザーを使用し、試料から散乱された光を収集して分光計へ導くことでブリュアン偏移を計測した 。OCTを用いて皮膚表面の位置を高速に追跡することで、動きによる誤差を排除し、計測されたブリュアン偏移を正確な深度に対応付けることに成功した 。手首での測定の結果、表皮において7 GHz付近と9から10 GHz付近の二つの山が確認され、後者は角質層における角質化した細胞の硬さに起因すると考えられる 。一方で真皮のブリュアン偏移は6.8 GHzと低く、表皮よりも剛性が低いことが示された 。本手法は、将来的に皮膚疾患が弾性特性に与える影響を非侵襲的に調査するための強力な道具となる 。

※本要約は、Optica Open Access Publishing Agreement に基づき、作成・公開されています。

論文で使用されたCoboltのレーザー

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　近年、脳の活動をマクロからミクロまで理解することが神経科学において重要であるとされている。特に、脳の構造は非常に複雑であり、局所的な神経活動を把握することと、脳全体の活動を把握することは別々の技術を必要とする。そのため、従来技術としてマクロスケールの技術（例えば、fMRI）とミクロスケールの技術（例えば、多光子カルシウムイメージングやマルチ電極記録）が開発され、脳活動の理解が進められてきた。
　fMRIなどのマクロスケールイメージング技術により、脳全体の機能的ネットワークや各領域の役割を把握することが可能である一方、多光子カルシウムイメージングなどは個々の細胞レベルでの活動を詳細に観察することができる。これにより、局所的な脳回路の高い多様性や、近隣の細胞間での異なる機能的特性を明らかにすることができた。さらに、光シート顕微鏡はゼブラフィッシュ幼虫などの透明なサンプルに対して有用で、深部組織の高速ボリュームイメージングを可能にしている。このように、従来の技術は、脳の各スケールに対応した詳細なデータを取得するために非常に有効であった。

　しかし、従来のマクロスケールおよびミクロスケールの技術では、それぞれの観測領域が限られており、全脳レベルでかつ細胞分解能で脳活動を同時に観察することは難しかった。また、fMRIは複数の細胞の平均的な活動を一つの値として表現するため、個々の細胞の活動を正確に把握することができず、多光子顕微鏡では観測可能な視野が限られているため、全脳活動の全体像を把握することが困難であった。さらに、脳のサイズや不透明性によっては、光シート顕微鏡を適用することも制限があった。このような技術的制約のため、脳の全体的な活動と局所的な細胞活動の関係を統一的に理解することは、依然として大きな挑戦となっていた。

　そこで、本研究では、従来の技術の制約を克服するために「ブレイズド斜平面顕微鏡（Blazed Oblique Plane Microscopy, BOPM）」を開発した。この技術により、脳全体の細胞分解能での神経活動を同時に記録することが可能となった。BOPMでは、サンプル内の斜めの平面を励起し、同一の対物レンズを使用して蛍光を収集することで、広い視野と高い分解能を両立することができた。また、光ファイバーを用いたフェースプレートを組み合わせることで、斜平面を効率的に再イメージングする手法を取り入れた。
　この技術を用いて、成体のDanionella cerebrum（透明な脳を持つ小型魚類）の脳全体の活動を記録し、スケール不変の神経活動の予測を行うことに成功した。実験結果から、局所的な細胞活動とマクロスケールのボクセル活動の間に強い相関が見られ、両者が類似した予測能力を持つことが示された。この結果は、従来のマクロスケール技術が必ずしもミクロスケール技術に劣っているわけではなく、それぞれのスケールが脳全体の活動を予測するために有効であることを示している。また、この技術を用いることで、脳全体の細胞活動を記録しながら、その活動の時間的および空間的相関を評価することが可能となり、脳の動的なネットワーク構造の理解が進展することが期待される。
　Cobolt社の488 nmレーザーは、励起光源として使用され、光シートを形成するために用いられた。このレーザーは高速の蛍光記録を可能にし、脳内での広範囲にわたる神経活動の観測をサポートした。また、CNI製の532 nmレーザーもシステムに組み込まれており、光ファイバーを介してシステム内に結合されて、光伝達効率を最適化するために利用されている。この532 nmレーザーは、ブレイズド斜平面顕微鏡の光学的なコリメーションと中間イメージングに重要な役割を果たしている。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

論文で使用されたCoboltの488nmレーザー

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　従来の振動分光ベースの顕微鏡技術は、細胞や組織の分子の振動遷移を利用することで、ラベル不要で化学的構造や分子組成に基づくコントラストを得ることができる。その中でも、コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）や刺激ラマン散乱（SRS）、中赤外（Mid-IR）顕微鏡は、細胞や組織に対する非侵襲的なラベルフリーのイメージングを可能にし、生体内の化学的な情報を高解像度で捉えることができるため、近年急速に研究が進められている。特に、ハイパースペクトル画像を取得することで、異なる脂質やタンパク質、糖質などの生体分子群を識別することが可能となり、これにより細胞の代謝過程を外部の蛍光標識を使用せずに観察することができる。
　BSTP（Bond-Selective Transient Phase Imaging）やMV-QPI（Molecular Vibration-Sensitive Quantitative Phase Imaging）など、広視野での中赤外光熱効果を利用した高速なハイパースペクトルイメージング技術が開発され、24フレーム/秒を超えるビデオレートでのラベルフリー中赤外イメージングを実現している。また、これらの技術は、広視野での光熱効果を利用することで、高速かつ高感度な分子コントラストの取得が可能である。このような背景から、振動分光顕微鏡技術は、生体内の化学的変化を迅速に捉えるために重要な役割を果たしている。

　しかし、これまでの振動分光イメージング技術では、高コンフルエンスの細胞集団を大きな視野で高速に撮影することが難しかった。例えば、BSTPやMV-QPIでは、高速なラベルフリーの中赤外ハイパースペクトルイメージングを実現しているものの、その視野は10〜50 μmに制限されており、大規模な細胞集団を捉えることができない。また、中赤外ハイパースペクトルイメージングにおいては、従来の機械的走査により長時間の露光が必要であり、これが細胞への光損傷のリスクを増加させる問題があった。さらに、広視野のフォーリエ変換赤外（FTIR）顕微鏡も開発されているが、これは主に乾燥した薄い組織片に使用されており、生きた細胞に対しては適用が困難である。これらの技術は、特に広視野での高感度なイメージングが求められる状況において、その限界が明らかであった。

　そこで、本研究では、フェーズシフト光熱顕微鏡（PSOM）を用いて、高コンフルエンスの細胞集団に対する中赤外ハイパースペクトルイメージングを実現した。PSOMは、広視野励起と偏光ベースのフェーズシフトモジュールを組み合わせることにより、サンプルの大きな固有位相を抑制し、高感度な化学コントラストイメージングを可能にする。この技術により、既存の光熱顕微鏡技術の50倍に達する視野でライブセルの中赤外イメージングを行い、さらに、従来の振動イメージングモダリティで使用される励起パワーフラックス密度（PFD）の1万分の1まで減少させることに成功した。これにより、細胞への光損傷リスクを大幅に低減しつつ、高感度なラベルフリーイメージングを実現している。
　PSOMを用いた実験では、成熟した脂肪細胞の脂質滴（LD）の高コンフルエンス下でのイメージングが行われ、従来の技術では観察困難であった大規模な細胞集団に対する定量的な解析が可能であることが示された。さらに、Cobolt社製の532 nmのパルスレーザー（Cobolt Tor）が、サンプル面での偏光状態の変化を読み取るためのプローブビームとして使用されており、光熱効果による分子コントラストの高感度な検出に寄与している。このレーザーは、低パワーでの高感度測定を実現するための重要な要素であり、フェーズシフト光熱顕微鏡の性能向上に大きく貢献している。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

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光熱顕微鏡に使用された532nmパルスレーザー

　ウイルス感染症の診断には、ウイルスの構成成分であるタンパク質や核酸を特定することが不可欠である。特に、核酸や表面タンパク質を標的とした従来の診断法は、ウイルス感染の早期発見に重要な役割を果たしてきた。これらの方法は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅技術や抗原検出を活用し、高精度なウイルス検出を可能にしている。さらに、ラベルフリー技術の進展により、ウイルスの光学的特性や形態の特徴を解析することが可能となり、特に干渉法を利用したイメージング技術がウイルスの検出と追跡に有効であることが示されている。
　中赤外フォトサーマル（MIP）顕微鏡は、赤外光の吸収を利用して化学的選択性を持つイメージングを行う技術であり、広くバイオマテリアルの解析に使用されてきた。MIPは可視光の回折限界を超えた解像度を持ち、細胞や細菌、ウイルスといった微細構造の化学的情報を取得することができる。この技術は、従来の赤外吸収法やラマン散乱法と比べてはるかに高い感度とスループットを持つため、ウイルス構造の詳細な化学成分を分析する上で大きな長所がある。

　しかし、従来のMIP顕微鏡はスキャン方式に依存しているため、取得に長い時間がかかり、スループットが低い問題があった。また、単一のウイルス粒子の化学的解析を行うには十分な感度を確保することが難しく、広視野でのウイルス検出や正確なスペクトル解析には課題が残されていた。さらに、ウイルスの化学的内容物を分析するには、従来の光学干渉法では分子情報の取得が不十分であった。

　そこで、本研究では、広視野干渉法を強化した中赤外フォトサーマル顕微鏡（WIDE-MIP）を開発し、単一ウイルスの高スループット指紋解析を実現した。この技術では、干渉によって散乱光の信号を強化し、さらに焦点位置を調整することでMIPコントラストを大幅に向上させた。これにより、従来のスキャン方式のMIPに比べて3桁のスループット向上を達成し、100nmサイズのポリメチルメタクリレート（PMMA）粒子の検出に成功した。
　実験では、単一のワクシニアウイルス（VACV）およびベシキュラーストマチチスウイルス（VSV）の指紋スペクトルを取得し、ウイルスタンパク質と核酸の化学的特徴を特定することができた。特に、DNAウイルスとRNAウイルスの核酸の違いを反映するサイミンおよびウラシルの残基振動を検出し、これらのウイルスの化学指紋を明確に識別した。また、広視野MIPは、ウイルスのタンパク質二次構造のβシート成分が豊富であることも示した。また、Cobolt社のレーザー（波長488 nm）は、蛍光イメージングのための励起光源として使用された。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

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　近年、ナノ構造物や分子の詳細な化学的構造を明らかにするために、フォトサーマル顕微鏡技術が急速に発展している。これは、局所的な熱勾配を光学的に検出することで高感度の化学イメージングを可能にする手法である。特に、可視光フォトサーマル顕微鏡や中赤外フォトサーマル顕微鏡がこれまでに開発されてきた。可視光フォトサーマル顕微鏡は、金ナノ構造の場増強効果を利用し、単一の光吸収性ナノ粒子をターゲットにしたイメージングに優れており、非蛍光色素分子や半導体ナノ結晶の検出に成功している。一方、中赤外フォトサーマル顕微鏡は、化学情報が豊富な「フィンガープリント領域」を利用することで、物質や生命科学において多くの応用がなされている。例えば、単一金属ナノワイヤのファブリ・ペロー共振モードのマッピングや、ペロブスカイトの局所的なカチオン不均一性の解明などが挙げられる。さらに、細菌の代謝応答や細胞・組織内のタンパク質の構造マッピング、そして中赤外報告子を用いた酵素活性のマッピングなど、生命科学の分野でも重要な成果を上げている。これらの技術は、ナノスケールでの詳細な化学構造の解明において、重要な役割を果たしている。

　しかし、可視光フォトサーマル顕微鏡は化学的特異性が乏しく、中赤外フォトサーマル顕微鏡は水の強い吸収による光の減衰が大きく、厚い組織のイメージングには適していない。特に、中赤外領域では水の吸収が強いため、組織内部の光減衰が顕著であり、測定時のバックグラウンドノイズが増大し、精度が低下する。また、従来の中赤外フォトサーマル顕微鏡は、光学的制約により高NA（開口数）対物レンズの使用が困難であり、その結果、解像度が低下する問題もある。

　そこで、本研究では、短波赤外（SWIR）領域での励起と可視光プローブを組み合わせた「オーバートーンフォトサーマル（OPT）顕微鏡」技術を提案し、これにより高い解像度と高い感度を同時に実現した。この技術は、C-H伸縮振動の2次オーバートーン領域でサンプルを励起し、局所的な熱レンズ効果を可視光で検出することで、化学特異性を高めながらも水の吸収による光減衰を避けることができる。実験では、SWIR波長をチューニングし、光走査により化学マッピングを行い、ポリマー構造や生細胞内のタンパク質および脂肪酸の深さ分解能を持つイメージングに成功した。さらに、マルチスケールの構造と化学組成の調査を可能にする大規模短波赤外イメージング技術との組み合わせにより、生物学的および材料科学の分野において有用な知見を提供することが期待される。

また、このOPT顕微鏡では、Cobolt社製の532 nmの連続波レーザー（Samba 532 nm）をプローブビームとして使用し、局所的な温度変化を検出することで、高い空間解像度と感度を実現している。このレーザーの使用により、信号のノイズレベルが大幅に低減され、精密な化学イメージングが可能となった。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

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フォトサーマル顕微鏡で使用された532nmレーザー

　繊毛はほとんどの真核細胞に突き出た感覚器官であり、外部の信号を細胞体に伝える役割を果たしている。そのため、繊毛の正常な機能は細胞の正常な動作にとって非常に重要である。繊毛内部には細胞体とは異なる特定のタンパク質のプールが必要であり、この異なる組成を維持するために、真核細胞は特殊な細胞内輸送システムである**繊毛内輸送（IFT）**を使用している。IFTは、主にIFT-BおよびIFT-A複合体からなる大規模なポリマー構造であり、これらの複合体が規則的に繰り返されることで形成される。IFTトレインは、繊毛基底部で組み立てられ、キネシン-2モーターによって駆動されることで、繊毛基底部から移行領域（TZ）を経て繊毛の先端まで輸送される。C. elegansにおいては、順行性IFTは、ヘテロ三量体キネシン-IIとホモ二量体OSM-3の2つのキネシン-2モーターによって駆動される。キネシン-IIは移行領域を越える際に順行性IFTトレインをナビゲートし、その後徐々に速いOSM-3に置き換えられて、繊毛の先端まで輸送される。従来の研究では、蛍光回復法（FRAP）や構造解析により、繊毛基底部で順行性IFTトレインが段階的に組み立てられることが示されている。IFT-B複合体がテンプレートとして機能し、IFT-A、IFT-ダイニン複合体、およびキネシン-IIが順次結合することでトレインが形成される。さらに、いくつかの繊毛膜タンパク質が順行性IFTトレインに結合して移行領域を越えることが示されている。

　しかし、順行性IFTトレインがどのようにして繊毛基底部で組み立てられ、どのようにしてタンパク質がこれに結合するかはまだ完全には理解されていない。また、繊毛基底部でのIFTトレインの動態や、異なる繊毛タンパク質がどのようにしてIFTトレインと結合して移行領域をナビゲートするかについての理解も不十分である。

　そこで、本研究ではC. elegansの化学感覚ニューロンの繊毛をモデルシステムとして使用し、単一分子イメージングを用いて、キネシン-II、OSM-3、およびIFT-ダイニンモーターとチューブリンが繊毛にどのように入るかを直接観察した。**小窓照明顕微鏡法（SWIM）**を使用して、PHA/PHBニューロンペアの繊毛におけるこれらのタンパク質のエントリーを可視化し、単一粒子追跡を行った。これにより、IFT成分が時間的および空間的に順次トレインに結合することが示された。また、野生型および変異体の線虫におけるIFT成分の超解像マッピングを行い、キネシン-IIが軸糸の組織化に不可欠であることを明らかにした。特に、キネシン-IIおよび/または移行領域機能を欠く繊毛のイメージングにより、キネシン-IIとOSM-3の相互作用がIFTトレインを効率的に移行領域を越えて運ぶ上で重要な役割を果たしていることが示された。本研究では、Cobolt社製レーザーを用いて、SWIM法による単一分子イメージングのための蛍光励起および漂白に使用した。Cobolt社製のレーザー発振器は高いレーザー強度を提供し、長時間にわたり高信号対背景比の単一分子イベントのイメージングを可能にする。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

論文で使用されたCoboltの561nmレーザー

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　ブドウ膜炎は、ブドウ膜の炎症を特徴とする疾患であり、視力損失の5〜10％を引き起こす。自己免疫または非感染性ブドウ膜炎は、神経網膜における全身性の炎症状態を伴い、視力を脅かす難治性の状態である。特に、網膜血管の炎症が血管の漏出や閉塞を引き起こし、網膜の非再生細胞の重大な破壊をもたらすことがある。このような背景から、ブドウ膜炎患者における血管炎の理解と制御の必要性が高まっている。網膜蛋白質、特にインターフォトレセプターレチノイド結合タンパク質（IRBP）に対する自己免疫応答が見られる患者が多く、IRBPは視覚サイクルにおいて重要な役割を果たす蛋白質であり、実験的自己免疫性ブドウ膜炎（EAU）の誘発に広く使用されている。近年の研究では、IRBP免疫化により誘発されるEAUが、血管漏出や浮腫を特徴とし、網膜内血液網膜関門（BRB）の破壊が重要な病因であることが示されている。また、BRBは血液脳関門（BBB）と同様に、タイトジャンクションによる細胞間輸送制限と不活性トランスサイトーシスによる細胞内輸送制限に依存している。近年、網膜血管疾患の病因においてトランスサイトーシスの役割が注目されており、特に非感染性ブドウ膜炎における網膜血管炎の病態生理学に関する新たな知見が得られている。

　しかし、EAUにおけるBRBの破壊がどのようにして起こるのかは十分には解明されていない。特に、炎症性細胞の活性化やトランスサイトーシスの誘導が血管漏出にどのように寄与するかについての理解が不足している。また、従来の研究では、IRBP免疫化により誘発されるEAUモデルの慢性再発性ブドウ膜炎を再現することが難しいという課題がある。さらに、網膜血管の深層層における血流減少や微小血管の構造変化に関するデータも限られており、これらの問題点を解決するためには、より高度な解析技術と新たな実験モデルの開発が求められている。

解決方法と実験結果

　そこで、本研究では、IRBP免疫化により誘発されたEAUマウスモデルを用い、マルチモーダルイメージング技術を駆使して血管表現型を詳細に解析した。具体的には、IRBPまたはビークルを全身投与したC57BL/6マウスに対して、眼底写真撮影、光干渉断層撮影（OCT）、蛍光色素を用いた生体内ライブ共焦点イメージング、OCTアンジオグラフィー（OCTA）、およびエレクトロレチノグラフィー（ERG）を実施した。その結果、EAUマウスでは、周囲血管炎、硝子体炎、眼底写真およびOCTで表層網膜炎症が観察された。さらに、免疫細胞の浸潤や血管透過性の変化が確認され、免疫細胞抑制によりトランスサイトーシスの改善が見られた。また、in vivo共焦点イメージングにより、好中球の浸潤や血管炎が明らかになり、OCTAでは深層毛細血管層における血流の著しい減少が示された。機能解析では、免疫化3週後には暗所視応答が保持されていたが、光所視および暗所視応答はほとんど検出されなかった。これらのデータは、炎症性細胞の活性化および内皮細胞におけるトランスサイトーシス誘導が、ブドウ膜炎における血管漏出の主要な病因であることを示唆している。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

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論文で使用されたCoboltの488nm, 561nm, 赤色レーザー

　従来のバルク材料に比べて大きな表面積を持ち、高い触媒反応性や光学特性を有するナノ粒子は、その独特な物理的および化学的特性から、商業および医療応用において急速に普及している。これに伴い、ナノ粒子の環境および人間の健康への影響に対する関心が高まっている。動物実験の代替法の需要が増加する中で、ナノ粒子のリスク評価には適切なin vitro（試験管内）方法が重要である。デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）は、定量的位相イメージング（QPI）の干渉計型バリアントとして、ナノ粒子の細胞毒性評価における有望な無標識法として示されている。DHMはサンプルとの相互作用が最小限であるため、さらなる解析に適しており、ナノ粒子の細胞への影響を正確に評価するための信頼性の高い方法として注目されている。

　しかし、ナノ粒子は独特の特性を持つため、従来の生化学的試験方法との干渉が生じやすい。これにより、従来の方法ではナノ粒子の影響を完全に評価するために複数の試験が必要となり、一貫した結果を得ることが困難である。また、色素や蛍光を利用した光学的読み出しシステムにおいて、ナノ粒子の高い吸着能力や反応性が測定結果に誤差をもたらすことがある。

　そこで、本研究ではDHMを用いた無標識の細胞毒性評価法を提案することによって、これらの問題を解決した。DHMは、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子を用いた細胞の乾燥質量増加を測定し、同じ細胞集団に対する生化学的アッセイ（WST-8およびLDH）と直接比較した。具体的には、RAW 264.7マクロファージおよびNIH-3T3線維芽細胞の乾燥質量増加を定量化し、その後、WST-8を用いて細胞の代謝活性を測定し、LDHアッセイで細胞死を評価した。DHMは、ナノ粒子の細胞毒性効果を検出する感度が高く、生化学的アッセイと比較して優れた結果を示した。DHMを用いた評価では、低濃度のナノ粒子でも細胞毒性効果を検出できることが確認された。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

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ホログラフィーに使用された532nmレーザー