薬物送達やmRNAワクチン、診断、水質監視など、液中のナノ材料を扱う技術が広がり、粒径や濃度を正確に把握することが安全性と品質の保証に不可欠である。この用途では、粒子のブラウン運動に伴う散乱光の強度ゆらぎから粒径を求める動的光散乱法（DLS）が標準である。一方、可干渉性の高い光が散乱体を通ると無数の散乱光が干渉し、斑点状の模様が生じる。これがレーザースペックルであり、光と媒質の相互作用で決まるため再現性があり、時間変化から媒質内部の微細な動きを読み取れる。

　しかし、DLSは単一散乱を前提に希薄で均一な分散を仮定するため、低濃度では散乱光が足りず感度が失われ、高濃度では多重散乱によって精度が落ちる問題点がある。さらに検出器を特定の角度へ置く必要があり、粒径への換算には温度や粘度、屈折率などの事前情報を要する。多重散乱下で使える拡散波分光法もあるが、試料形状や平均自由行程を別途決める必要があり、未知試料には向かない。

　そこで、本研究では多重光散乱をあえて最大化するレンズを用いない光学系を構成することによって、解決した。内面で光を繰り返し反射させるアルミニウム製の試料保持具を自作し、位相のそろわない光で試料全体を照らした。Cobolt社製の532 nmレーザー（Cobolt Samba）は、保持具へ直接入射させて多重散乱による干渉場をつくる光源として使用された。射出窓には結像光学系のないCMOSカメラを置き、スペックルの時系列を二次元ピアソン相関で解析した。その結果、直径200 nmの粒子を10⁵個/mLまで識別でき、DLSの検出限界より3〜4桁低い濃度を捉えた。濃度固定の条件では、検量式により100〜200 nmの粒径を95%予測区間±7 nm以内で決定できた。

※本記事は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）を、独自の構成で再構成した日本語要約です。

【用語解説】

• 動的光散乱法（DLS）：液中の粒子がブラウン運動する際に生じる散乱光の強度ゆらぎを測り、その時間相関の減衰から拡散係数を求め、ストークス・アインシュタインの式で粒径に換算する手法。温度・粘度・屈折率の値を前もって与える必要がある。
• レーザースペックル：可干渉性の高い光が粗面や散乱体で散乱されたとき、多数の散乱光が互いに干渉して生じる斑点状の明暗模様。媒質が動くと模様も時間とともに変化する。
• 拡散波分光法（DWS）：光が何度も散乱される濃い媒質に対し、光の伝わりを拡散として扱い、散乱光の時間相関から粒子の運動を解析する手法。試料形状や平均自由行程などの模型の値が必要となる。

レーザースペックル計測に使用された532 nmレーザー

　両親媒性分子が水溶液中で自発的に集合体を形成する界面活性剤は、洗浄、食品、医薬品など多くの産業分野で重要な役割を果たしている。特に、微生物由来の生体界面活性剤やペプチド両親媒性分子は、従来の合成界面活性剤と比較して生分解性に優れることから、環境に配慮した代替物質として注目されている。一方、脂質修飾ペプチドは、天然ペプチドと比較して薬物動態特性が向上することから、治療薬としての関心が高まっている。脂質修飾によりペプチドはアルブミン結合能を獲得し、血中循環時間の延長と投与頻度の低減が可能となる。MEDI7219は、2型糖尿病および肥満治療を目的として開発されたGLP-1類似体であり、30個のアミノ酸からなるペプチド骨格の13位と25位のリジン残基にC11脂質鎖が結合した二重脂質修飾構造を有する。

　しかし、脂質修飾ペプチドの両親媒性構造はミセルや二重層への自己集合を引き起こす可能性があり、この凝集挙動は製剤の安定性、免疫原性応答の誘発、および皮下投与後の吸収動態に影響を与えうるという問題点がある。凝集体の構造を解析する手法の開発は、医薬品ペプチドの製造・保存・投与における課題を特定するために不可欠である。

　そこで、本研究では小角X線散乱法および動的光散乱法を用いてMEDI7219の自己集合挙動を詳細に解析することによって、その凝集機構を解明した。動的光散乱測定にはCobolt社製Samba 50 mW固体レーザー（波長532 nm）を光源として使用し、ペプチド凝集体の流体力学的半径を決定した。その結果、MEDI7219は非常に低い臨界ミセル濃度を示し、水中で約11 μM、150 mM塩化ナトリウム溶液中では約110 nMであった。形成されるミセルは核殻構造を持つ三軸楕円体であり、会合数は5〜8と従来の界面活性剤と比較して著しく小さく、高い自発曲率を有することが明らかとなった。さらに、ミセルの大きさは電解質の種類、pH、緩衝液、温度などの環境条件に対して驚くほど非感受性であった。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

動的光散乱に使用された532nmレーザー

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　抗菌性多糖類（ＡＭＰ）は、生体の自然免疫系の一部として多様な生物に存在する天然の化合物であり、従来の抗菌薬とは異なり、その両親媒性によって細菌の細胞膜に親和性を持ち、物理的に膜を破壊する作用機序を有している 。中でもコリスチン（ポリミキシンＥ）は、グラム陰性菌の外膜に存在する負電荷の脂質Ａと静電引力によって強く結合し、内膜を貫通して細菌を死滅させる非常に強力な薬剤である。近年、多剤耐性菌の脅威が増す中で、コリスチンは最後の手段として重要な役割を担っており、安価で高い治療効果が期待できるため、その有効な活用方法が模索されている。薬剤の運搬手法として注目される複合コアセルベーションは、反対の電荷を持つ高分子間の静電相互作用と対イオンの放出により、水溶性の複合体相を形成する現象である。この手法で形成される複合コアセルベート核ミセル（Ｃ３Ｍｓ）は、電荷を持つ薬剤を核（コア）に閉じ込め、周囲を親水性の外殻（シェル）で覆うことで、溶液中での高い分散安定性を維持することが可能となる 。これにより、薬剤の機能を保持したまま、外部環境からの保護や体内での滞留性を向上させることができる 。

　しかし、コリスチンは高い有効性を持つ一方で、腎毒性や神経毒性を引き起こす副作用が大きな課題となっており、一時は臨床使用が制限されていた経緯がある 。また、生体内における安定性が低く、蛋白質分解酵素による分解を受けやすいことや、水溶性の低さに起因する生物学的利用能の低さが治療上の制約となっている。

　そこで、本研究ではコリスチンとポリエチレンオキシド・ポリメタクリル酸（ＰＥＯ－ｂ－ＰＭＡＡ）ブロック共重合体を複合コアセルベーションさせることで、化学修飾を伴わない安定なナノ粒子の構築を行った 。ナノ粒子の粒子径および経時的な分散安定性を評価する目的で、Cobolt社製の固体レーザーを用いた動的光散乱（DLS）測定を実施し、電荷が均衡する条件下で最も安定なミセルが形成されることを明らかにした 。結果として、得られたナノ粒子は蛋白質分解酵素であるプロテインキナーゼＫやサブチリシンによる分解から薬剤を保護し、非複合体状態と比較して分解速度を大幅に抑制することに成功した 。さらに、大腸菌に対する抗菌活性を維持しつつ、人血清アルブミンの結合による構造変化も限定的であることを確認しており、毒性を低減しながら有効性を保つ新たな薬剤製剤としての可能性を示した 。

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動的光散乱に使用された660nmレーザー

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　液体中に微粒子が分散したコロイド混合物の乾燥過程は、多機能な被膜を一段階で形成できる手法として、塗料や化粧品、食品など幅広い産業で注目されている 。粒子分布を制御することで、表面には耐摩耗性、基材側には密着性といった異なる機能を付与した「傾斜構造」を自発的に構築できるからである 。この構造形成に寄与するのが「自己成層化」であり、特に、溶媒の蒸発に伴う濃度勾配が粒子を押し戻す「拡散泳動」という物理現象が重要な役割を果たす 。拡散泳動は、粒子間の非対称な相互作用により特定の粒子を表面へ濃縮させる力を生む 。また、これとは別に、濃度上昇に伴い粒子が熱力学的に集まる「相分離」も膜の微細構造を決定する要因となる。

　しかし、従来の自己成層化の研究は垂直方向の濃度勾配にのみ焦点を当てており、乾燥中の高い粒子濃度下で生じる熱力学的な相分離の影響を無視していた 。二つの分離機構が同時に進行する際の相互作用や、最終的な膜構造への影響は未解明であった。

　そこで、本研究では三次元共焦点顕微鏡を用い、成層化と相分離の同時進行をリアルタイムで定量化した 。粒子のサイズ分布を測定するため、Cobolt社製レーザーを光源とする動的光散乱法が使用された 。その結果、粒子径比が一定を超えると相分離が膜形態を支配し、蒸発速度を遅くすると成層化が抑えられ相分離ドメインが大型化することを突き止めた。

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動的光散乱法に使用された660nmレーザー

　散乱媒質越しの非侵襲光学イメージングは、生体観察や大気ゆらぎ下での遠隔観測などに不可欠であり、近年大きく進展している。アイソプラナティック条件下では像は物体関数と点像分布関数の畳み込みで表される。反射行列に基づく行列分解法やI-CLASS法は、この関係を利用して散乱の影響を分離し、高解像度像を再構成できる強力な枠組みである。これらは蛍光顕微鏡やホログラフィーにも適用可能であり、理論的解釈性に優れる。

　しかし、従来の行列法は静的散乱を前提とし、媒質の相関時間内に多数の異なる照明で計測する必要があるため、血流や霧のような急速に変動する動的散乱には適用困難である。ニューラルネットワーク法も時間変化の仮定や学習データに依存する制約がある。

　そこで、本研究では畳み込みの可換性に着目し、動的散乱下で得た画像列の共分散行列が静的媒質の反射行列と同形式になることを示し、I-CLASS法を直接適用する手法を提案した。625 nm光源による透過観察、粒子懸濁液による自然動的散乱、蛍光顕微鏡、反射型ホログラフィーで有効性を実証した。蛍光励起にはCobolt社製488 nm、出力200 mWの連続波レーザーを用い、均一照明を実現した。

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論文で使用されたレーザー

　近年、薬剤耐性菌（多剤耐性菌、MDR菌）の増加により、抗生物質の新たな製剤開発が急務となっている。特に、抗菌ペプチド（AMP）は、自然界に広く存在する生体防御因子であり、細胞膜を標的とする作用機序から、従来の抗生物質に対する耐性が生じにくいことが知られている。その中でもポリミキシン系抗生物質の一種であるコリスチンは、グラム陰性菌に対して強力な殺菌作用を持つ。コリスチンは1947年に発見され、当初は広く使用されたが、腎毒性および神経毒性が報告されたため1980年代に使用が制限された。その後、MDR菌の蔓延に伴い再評価され、現在では最終手段として再び医療現場で利用されている。コリスチンは陽イオン性のペプチドであり、陰性に帯電した細菌外膜のリポ多糖（LPS）と選択的に結合することで細胞膜を破壊し、殺菌効果を発揮する。これらの特性から、コリスチンの効果を保持しつつ毒性を軽減できれば、有望な抗菌剤として広く応用できる可能性がある。

　しかし、従来のコリスチン製剤には安定性、水溶性の低さ、ならびに生体内での急速な分解といった問題点がある。これに対処するため、コリスチンを他成分と複合化し、ドラッグデリバリーシステム（DDS）として利用する研究が多数行われてきた。例えば、ヒアルロン酸やキトサン誘導体との結合、リポソームや固体脂質ナノ粒子、PLGAナノ粒子、ナノ構造脂質キャリアへの封入などが提案されてきたが、いずれもコリスチンの化学的修飾や複雑な製造工程を要する。また、従来のDDSでは製剤のコロイド安定性や生理条件下での分解耐性が十分ではなく、薬効の保持が困難であることが指摘されている。特に、抗菌ペプチドの多くはプロテアーゼにより分解されやすく、in vivoでの安定性が著しく低いことが課題であった。

　そこで、本研究では、コリスチンと陰イオン性ブロック共重合体であるPEO-b-PMAA（ポリエチレンオキシド−ブロック−ポリメタクリル酸）との間で静電相互作用により形成される複合コアセルベートコアミセル（C3Ms）を用いて、安定なナノ粒子の形成を試みた。C3Msは、陽イオン性のコリスチンと陰イオン性PMAAがミセルのコアを形成し、中性のPEOがコロナ（外殻）を構成することで、コロイド安定性を確保している。本研究では、3種の異なるブロック長を持つPEO-b-PMAA（P1: PEO₄₅-b-PMAA₄₁、P2: PEO₄₅-b-PMAA₈₁、P3: PEO₁₁₄-b-PMAA₈₁）を用い、様々な荷電比（f⁺）においてC3Msの形成と安定性を評価した。
動的光散乱（DLS）および小角X線散乱（SAXS）を用いて評価した結果、f⁺ = 0.50（荷電中和条件）において、最も高いコリスチン封入効率と長期安定性を示すことが明らかとなった。形成されたナノ粒子は直径35〜40 nm程度で、長期保存でも凝集せず、酵素分解耐性や血清タンパク質との非特異的結合も抑制された。さらに、抗菌活性（E. coliを対象としたMIC50およびディスク拡散法）では、自由なコリスチンとC3Msで同等の活性を示し、活性保持が確認された。加えて、ヒト細胞（HEK293細胞、MSC、HUVEC、HGK）に対する細胞毒性試験では、C3Msはコリスチンと同等の低毒性を示し、毒性の増加は見られなかった。酵素（プロテイナーゼKおよびサブチリシン）による分解試験でも、C3Msはコリスチン単独と比較して高い分解耐性を示した。以上より、本研究で開発されたコリスチン−PEO-b-PMAA複合ミセルは、高い安定性と薬効保持性を兼ね備え、既存の問題を解決する新たな抗生物質製剤として、注射製剤への応用可能性を示した。

動的光散乱で使用された660nmレーザー

Cobolt社製レーザー発振器（660 nm, 100 mW DPSS）は、動的光散乱（DLS）測定においてナノ粒子のサイズおよび安定性を高精度で評価するために使用された。

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