蛍光顕微鏡は細胞や細胞内構造を可視化する不可欠な道具となったが、その性能は波面収差に本質的に縛られている。収差は試料内の屈折率の不均一さ、光学系の位置ずれ、構成部品の不完全さから生じ、回折限界の分解能を妨げ、画質・コントラスト・信号対雑音比を損なう。これを測って打ち消すのが補償光学であり、もとは大気のゆらぎを補正する天文用の技術として発達し、のちに生体イメージングへ移された。顕微鏡では一般に、シャック・ハルトマン波面センサーで波面の歪みを直接測り、可変形鏡や空間光変調器で補正する。近年は専用センサーを置かず画像そのものから収差を推定する計算的補償光学が注目され、なかでも既知の位相（デフォーカスなど）をわざと加えた複数枚の画像から未知の収差と物体構造を同時に解く位相ダイバーシティ法が有望視されている。

　しかし、センサーを用いる方式は光学系を複雑にし、コストと位置合わせ誤差を増やすうえ、視野内に点状の参照光源（ガイドスター）を必要とする。生体試料には自然には存在せず、二光子励起や蛍光ビーズの埋め込みで人工的に作らねばならず、広視野では複数個を分布させる必要がある。一方、2024年に蛍光顕微鏡へ導入された解析的な位相ダイバーシティ法は、理想化した光学配置を前提とする固定式の数値最適化に依るため、実機のわずかな幾何学的ずれやハードウェアのばらつきがあると、推定した収差が真の位相歪みを捉えきれない。さらに、視野全体で収差が一様であると仮定するため、およそ100 µm²を超える領域では前提が崩れ、複数枚を撮る間は物体が静止しているとも仮定しているため、生きた試料のドリフトや神経活動には対応できない。

　そこで、本研究では結像過程を微分可能な計算グラフとして表し、系の校正パラメータまで同時に最適化するGRAPHYCS（graph-modeling and phase-diversity-based computational adaptive optics with self-calibration）を構築することによって、解決した。学習可能な校正パラメータが実機固有の非理想性を自動で補正し、局所ごとに収差をモデル化することで1 mm²を超える広視野の空間依存収差に対応し、時間変化する物体を組み込むことで動く試料も扱える。シミュレーションでは、理想条件を前提とする解析的位相ダイバーシティ法に対し波面推定精度が最大9倍向上した。実際の顕微鏡実験でも比較したすべての位相ダイバーシティ法を上回り、系由来と試料由来の双方の収差を補正できた。受精後4〜6日のゼブラフィッシュ幼生の脳（全神経細胞の核にGCaMP6sを発現）を深さ200〜300 µmでライトシート撮像した実験では、収差補正と神経活動の検出を同時に行うことができ、静止物体を仮定する従来の計算手法では届かない領域を示した。Cobolt社製の488 nmレーザー（06-MLD、HÜBNER Photonics）は、パウエルレンズと2枚の平凸シリンドリカルレンズを経て均一なライトシートを作る照明光として使われた。

※本記事は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）を、独自の構成で再構成した日本語要約です。

【用語解説】

• 波面収差：光が試料や光学系を通る際に、本来そろっているはずの波面が場所ごとに進み遅れを起こして歪むこと。歪んだまま結像すると点が点に集まらず、分解能とコントラストが落ちる。
• 補償光学：波面の歪みを測り、可変形鏡などで逆向きの歪みを与えて打ち消す技術。天体観測で大気のゆらぎを補正するために生まれ、生体イメージングへ応用された。
• 位相ダイバーシティ法：デフォーカスのような既知の位相をわざと加えた複数枚の画像を撮り、その組から未知の収差と本来の物体像を同時に推定する手法。専用の波面センサーを要しない。
• ガイドスター：波面を測る基準となる点状の光源。天文では人工的に作った輝点、顕微鏡では二光子励起の輝点や埋め込んだ蛍光ビーズが使われる。
• 微分可能な計算グラフ：結像の各段階を微分可能な演算の連なりとして書き下したもの。誤差を逆向きにたどれるため、収差だけでなく系の校正値まで同時に最適化できる。

ライトシート照明に使用された488 nmレーザー

]]> https://sakuraphotonics.jp/cobolt/660nm-laser-full-vibrational-spectroscopy/ Tue, 08 Sep 2026 05:35:44 +0000 https://sakuraphotonics.jp/?p=14548 Behrouzitabar, M., Bērziņš, K., Vanna, R., Alcolea-Rodriguez, V., Boyd, B.J., D’Alfonso, L., Manzoni, C., Polli, D., Cerullo, G., Antonacci, G. “Full vibrational spectroscopy for simultaneous mechanical, structural and chemical analysis.” Nature Communications 2026, 17, 5632. https://doi.org/10.1038/s41467-026-74558-z

　物質の振動状態を光の非弾性散乱から調べる振動分光は、標識を必要とせず非接触で情報を得られることから、生体力学や製薬の分野で普及している。ブリルアン散乱は熱的に生じる密度ゆらぎ（音響フォノン）を捉え、0.1〜1 cm⁻¹ の偏移から粘弾性を与える。超低周波ラマン散乱は 10〜200 cm⁻¹ の分子間振動を捉えて結晶形の違いに鋭敏であり、通常のラマン散乱は 200〜3500 cm⁻¹ の分子内振動から化学組成を与える。三つを合わせれば、力学・構造・化学の情報が一度の計測で得られる。

　しかし、ブリルアン散乱と超低周波ラマン散乱の信号は励起光のごく近傍に現れる微弱な成分であり、レイリー散乱や界面反射に由来する強い弾性背景光に埋もれてしまう問題がある。走査型ファブリ・ペロー干渉計は分解能に優れる一方で1点あたり 10 s 以上を要し、高速なVIPA分光器はコントラストが約 30 dB にとどまる。三つの領域を同時に取得できる装置は実現していなかった。

　そこで、本研究では複屈折誘起位相遅延（BIPD）フィルタを導入することによって、解決した。複屈折結晶を二枚の偏光子で挟む構成であり、入口の偏光子が背景光の偏光を揃えるため、由来を問わず背景光を同じ原理で抑圧できる。光源にはCobolt社製の単一縦モードレーザー Flamenco（波長 660 nm）を用い、倒立顕微鏡の対物レンズで試料面に 8 mW で集光し、同じ対物で集めた後方散乱光をこのフィルタへ通したうえでVIPA分光器と回折格子分光器へ並列に導いている。これにより 0.1〜3500 cm⁻¹ を超える全域を同時に取得し、ブリルアン側で約 1 GHz の分解能と約 55 dB のコントラストを得た。インドメタシンの結晶形と非晶質相の識別に加え、イブプロフェン錠剤の力学・構造・化学の分布を同一視野で画像化できることを示した。

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【用語解説】

• ブリルアン散乱：物質中を熱的に伝わる音波（音響フォノン）による光の非弾性散乱。周波数の偏移量が弾性率と密度で決まるため、試料に触れずに粘弾性を測れる。
• 超低周波ラマン散乱：10〜200 cm⁻¹ 付近に現れる、分子どうしの並進や回転といった集団振動による散乱。結晶格子の並び方を反映するため、同じ化学組成でも結晶形の違いを見分けられる。
• VIPA（多重仮想位相配列）エタロン：入射光を斜めに導いて多重反射させ、わずかな波長差を大きな角度差に変換する分光素子。回折格子より分散が大きく、ブリルアン散乱のような微小な周波数偏移の測定に用いられる。

振動分光に使用された660 nmレーザー

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　蛍光顕微鏡は、生体の構造と機能を可視化できることから、生命現象の解明に欠かせない手法である。複数の蛍光標識を同時に追う場合、発光波長域が数 nm しか離れていない色どうしは、特定の波長帯だけを通して色を分ける従来の方式では分離できず、組織自身が出す自家蛍光も広い波長域で重なる。これに対し、各画素で連続した発光スペクトルを取得するハイパースペクトル蛍光撮像では、測ったスペクトルを各成分のスペクトルの重ね合わせとみなして係数を解くことで、重なった蛍光体と自家蛍光の寄与を成分ごとの量として取り出せる。ゼブラフィッシュのような中規模のモデル生物では、細胞の動態と個体全体の応答を同時に追える点で、この手法の価値が高い。

　しかし、生体内でのこの撮像は光子が足りないという問題がある。動きのある試料では露光時間を短くせざるを得ず、生体への負担を抑えるため励起強度も下げる必要があるうえ、わずかな蛍光光子を数百の波長帯に分割するため、1 帯域あたりの光子数が極端に少なくなる。その結果、散乱・散弾雑音・熱雑音が信号と深く結びつき、既存の深層学習による雑音除去は見た目を整えても本来のスペクトル構造を平滑化して壊してしまい、後段の成分分解が破綻する。教師データの作成自体が難しいという制約もある。

　そこで、本研究では光学系と演算処理を同時に開発することによって、解決した。共焦点の線走査方式によるハイパースペクトル・ライトシート蛍光顕微鏡を自作し、照明の線走査と検出側の逆走査を同期させて分光器へ導くことで、散乱と光毒性を抑えつつ光切片性を得た。ここでは Cobolt 社の多波長光源 Skyra の 488 nm 出力を走査鏡で振り、視野に線状の励起光として照射する構成をとっており、横方向 2.77 µm・深さ方向 4.84 µm の分解能を得ている。演算側では、二経路の残差注意機構と非負値行列因子分解を結合した深層学習網（DsRAN-NMF）を提案した。既存手法に対しスペクトル角で約 26.8〜42.4 %、PSNR で 3.12〜4.7 dB 改善し、6〜13 組という少数の教師データでも性能を保った。生きたゼブラフィッシュを 35 µW・30 ms の低励起条件で撮像し、血管とナノプラスチックを分離したうえで、暴露後 36〜72 時間で体節間血管内の蓄積が約 5 倍に増えることを示した。

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【用語解説】

• スペクトル成分分解（アンミキシング）：各画素で得た混合スペクトルを、既知または推定した成分スペクトルの重ね合わせとして解き、成分ごとの寄与量に分ける処理。
• ライトシート蛍光顕微鏡：試料を薄い板状の光で横から照らし、その面だけを直交方向から撮像する方式。面外を励起しないため退色と光毒性が小さい。
• 非負値行列因子分解（NMF）：行列を、負の値を含まない二つの行列の積に近似分解する手法。強度が負にならない分光データの成分分離と相性がよい。

ライトシート照明の線状励起に使用された488 nmレーザー（Cobolt Skyra）

　冷間加工した金属のひずみを取り除く熱処理である焼鈍は、鋳造や圧延、鍛造の後に広く行われる工程であり、回復・再結晶・粒成長という段階を経て結晶粒組織が作り替えられる。小さな結晶粒は強度と延性を両立するため、冷間加工と再結晶は微細な組織を得る手段として意図的に用いられる。目的の組織を得るには加工量・温度・時間の管理が要るため、工程の途中で組織を非破壊で見張れれば、材料の状態を的確に制御でき、製造時間の最適化にもつながる。試料表面を伝わる弾性波の位相速度を測って結晶方位の分布を画像化する空間分解音響分光法は、走査が速く、動的な組織変化の撮像に適している。

　しかし、組織の確認は工程の最後に光学顕微鏡やX線回折、硬さ試験で行うのが一般的であり、変化の過程そのものは見えない。実時間観察ができる後方散乱電子回折や高温共焦点レーザー走査顕微鏡は、走査できる試料寸法が限られ、厳密な試料調製を要する。縦波の減衰から粒径を推定するレーザー超音波法は非接触で高温にも使えるものの、組織を直接撮像できず、粒径は間接的な推定にとどまる問題点がある。

　そこで、本研究では加熱台を組み込んだ空間分解音響分光法でβスズを連続走査することによって、解決した。室温から10 ℃刻みで200 ℃まで昇温しつつ4分ごとに走査した処理では、80 ℃付近で新たな結晶粒が生じる様子が捉えられ、平均速度は50〜110 ℃で上昇したのち緩やかに低下し、再結晶と粒成長を区別できた。60 ℃で24時間保持した処理では最初の30分で再結晶が進み、粒径は74 μmから150 μmへ増大した。Cobolt社製の532 nmCWレーザーは、赤外Qスイッチレーザーが励起した表面弾性波による表面の揺らぎを読み取る探査光として使われ、波の周波数から速度を求めた。

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【用語解説】

• 表面弾性波：固体の表面近くに閉じ込められて伝わる弾性波。深さ方向には波長程度で振幅が減衰し、伝わる速さは表面付近の弾性率と密度、そして結晶方位で決まる。本研究ではこの速度の分布そのものが組織の像となる。
• 再結晶：冷間加工で蓄えられたひずみを駆動力として、ひずみのない新しい結晶粒が生じて成長し、加工組織が置き換わる現象。先行する回復、後続の粒成長とあわせて焼鈍の三段階をなす。
• 平均線分法：組織の像に直線を引き、その長さを結晶粒界と交わった回数で割ることで平均の粒径を求める方法。

表面弾性波の検出に使用された532 nmレーザー

　赤外からテラヘルツ帯の放射は、非破壊検査や医用診断、分光、次世代の無線通信を支えることから、その強度を正確に測る検出器の研究が急速に進められている。この帯域は電波と光波の中間にあり、発生も検出も難しい「テラヘルツギャップ」と呼ばれる。吸収した放射を熱に変えて測る熱型の検出器は、室温で動作し広い波長域に応答する。酸化グラフェンは可視域からテラヘルツ域まで広帯域に光を吸収し、塗布で成膜でき安価である。シリコーン樹脂の一種であるポリジメチルシロキサンは、高分子材料のなかでも温度による屈折率の変化（熱光学係数）が大きい。金属薄膜の表面で自由電子の集団振動を光で励起する表面プラズモン共鳴は、接する媒質のわずかな屈折率変化を鋭敏にとらえる。

　しかし、光子を直接電気信号に変える光子型の検出器は熱雑音を抑えるために極低温の冷却を要し、熱型の検出器は熱の逃げや周囲の温度揺らぎで感度が制限され、真空封止や機械的な変調を要する問題点がある。

　そこで、本研究では銀薄膜の上にポリジメチルシロキサンと酸化グラフェンを重ね、クレッチマン配置の表面プラズモン共鳴で読み出すことで解決した。酸化グラフェンが入射した放射を熱に変え、樹脂の屈折率が下がって共鳴角が低角側へ移動する。有限要素法で構造を最適化し、実験では 0.083 deg/mW の角度感度を得た。検出限界と分解能はいずれも 15 nW 程度で、屈折率変化にして 1.3×10⁻⁸ に相当する。Cobolt社製の 405 nm 連続発振レーザー（06-MLD、150 mW）は試料を加熱するポンプ光源として使用され、酸化グラフェン層の吸収率の測定、共鳴角の校正曲線の取得、矩形波で変調した微小電力の検出試験に用いられた。

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【用語解説】

• テラヘルツギャップ：おおむね 0.1〜10 THz の周波数帯。電子回路による発振の上限と、半導体発光素子の下限のあいだにあたり、実用的な光源も検出器も乏しかったことからこう呼ばれる。
• クレッチマン配置：プリズムの底面に金属薄膜を密着させ、全反射する光の染み出し（エバネッセント波）で表面プラズモンを励起する構成。共鳴の起こる入射角は金属に接する媒質の屈折率でわずかに変わるため、反射率の角度依存性から屈折率の微小変化を読み取れる。
• 熱光学係数：温度が 1 K 変わったときの材料の屈折率の変化量（dn/dT）。ポリジメチルシロキサンでは −4.5×10⁻⁴ K⁻¹ と大きく、温度が上がると屈折率が下がる。

光熱変換の励起に使用された405 nmレーザー

　細胞内の分子の働きを捉えるには、光学顕微鏡の回折限界である約 250 nm を超える分解能が必要である。集光した励起光で試料を走査し、多画素の検出器で蛍光を捉える画像走査顕微鏡（ISM）は、各画素を微小な絞りとして働かせ、得た信号を励起点の中心へ半分戻す「画素再配置」により点像分布関数を細め、共焦点顕微鏡の2倍の横方向分解能を与える。数百の微小穴と微小レンズを刻んだ2枚の回転円板で多数の焦点を同時に走査する共焦点回転円板（CSD）と組み合わせれば取得速度は約100倍に高まる。蛍光観察では色の情報も分解能と同じく重要である。

　しかし、CSDを用いたISMで多色像を得る従来法は、色ごとに濾光器を替えて順に撮る方式であり、1色あたり数百枚を要するため取得時間が大きく延びる問題点がある。撮影の時刻が色ごとにずれるため、時空間的な偽像も生じる。視野を分けて同時記録する方式は視野が狭まり、光を大きく分散させる分光方式は各点像が広い画素領域へ広がるため、実効的な視野と処理量が制限される。

　そこで、本研究では検出光路に自作の直線アミチプリズムを挿入することによって解決した。回転円板が作る疎らな輝点の配列は輝点の周囲に余白があり、そこへ蛍光の波長成分を短く分散させれば、1回の取得で全ての色情報を同時に符号化できる。円板の回転と閃光励起の同期は、安価な数値信号処理器で行った。Cobolt社製の 561 nm レーザー（Jive）と 638 nm 半導体レーザー（06-MLD）は、音響光学可変濾光器を備えた光源結合器に組み込まれ、試料面で 0.22 mW と 0.5 mW の弱い励起光として蛍光色素を励起する目的で使用された。3色の蛍光微粒子では、従来3回必要だった取得を1回に短縮しつつ1.74倍の分解能向上と正確な色の判別を達成し、神経細胞では1回250枚の取得で4種の標識を同時に撮像できた。

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【用語解説】

• アミチプリズム：屈折率と分散の異なる硝材を貼り合わせた分散素子。ある基準波長の光はまっすぐ通し、他の波長を波長に応じて曲げる。本研究では波長と像面上の位置がほぼ比例するよう設計され、検出光路で蛍光を短い距離だけ分散させる役割を担う。
• 点像分布関数：点状の光源が光学系を通ったときに像面へ広がる強度分布。その幅が分解能を決め、狭いほど細かい構造を見分けられる。画素再配置はこの幅を実効的に半分にする。
• 音響光学可変濾光器：結晶に超音波を加えて生じた屈折率の周期構造で光を回折させ、通す波長と強度を電気的に高速で選ぶ素子。複数のレーザーを1本に束ねた光源で、波長ごとの出力を切り替えるのに使う。

多色蛍光観察に使用された561 nm・638 nmレーザー

　コヒーレントな光を重ね合わせ、生じた干渉縞を感光性樹脂へ転写するレーザー干渉リソグラフィは、周期が数百 nm の微細な構造を数 cm² にわたり短時間で作製できることから、回折格子やフォトニック結晶、プラズモン構造の作製に広く用いられている。中でも、発散する光の一部を平面鏡で折り返し、直接試料へ届く光と干渉させるロイドミラー配置は、鏡と試料を同一の剛体架台に直角に固定できるため、機械的な振動が両者に等しく及び、光路差が乱れにくい。

　しかし、従来のロイドミラー配置は、自由空間を伝搬するレーザーとレンズ・ピンホールからなる空間フィルタを組み合わせるため、ピンホールを集光点の中心へ正確に置く必要があり、ビームの向きがわずかに揺らぐだけで露光中に干渉縞が流れ、模様がぼやける問題点がある。指向安定性の高い高価なレーザーを要するうえ、ピンホールも小さすぎれば回折で波面を歪め、大きすぎれば空間雑音を通すため、径の選定が難しい。

　そこで、本研究では、ファイバと恒久的に接合された偏波保持単一モードファイバ結合の 405 nm 狭帯域半導体レーザー（出力 20 mW、コヒーレンス長約 9 mm）を光源に用いることによって解決した。単一モードファイバは基本モードのみを伝搬させるため、出射光は空間雑音を含まない滑らかな発散ビームとなり、空間フィルタが不要となるうえ、ビームの揺らぎにも影響されない。回転ステージで入射角を変えて周期 218〜395 nm の格子を作り分け、ガラス基板上では 20 秒の露光で周期 406 nm・線幅 80 nm の均一な格子が得られた。なお本論文では、コヒーレンス長が数 m のファイバ結合レーザーを用いれば、より広い面積の描画が可能と述べられている。

※本記事は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）を、独自の構成で再構成した日本語要約です。

【用語解説】

• ロイドミラー配置：1本の発散するレーザー光の一部をそのまま試料に当て、残りを平面鏡で折り返して重ね合わせ、干渉縞を作る配置。光を二手に分ける素子が要らず、鏡と試料を同じ架台に固定できるため振動に強い、最も簡素な干渉リソグラフィの構成。
• 空間フィルタ：レンズで光を絞ってピンホールに通し、光学部品の塵や傷が生む細かな明暗の乱れを取り除いて、滑らかな波面を得る光学系。
• コヒーレンス長：光の位相のそろいが保たれる伝搬距離。発振周波数が一つに絞られた単一縦モードのレーザーほど長く、二つの光路の差がこれを超えると干渉縞が現れないため、干渉リソグラフィで描ける面積の上限を決める。

レーザー干渉リソグラフィ向けの405 nmレーザー

　金属の細線を局所的に形成する技術は、センサや光電子素子、脳の情報処理を模した神経模倣計算の発展に欠かせない。前駆体の溶液から光を当てた場所だけに金属を析出させる光触媒的成長は、化学的に溶かして元へ戻せる可逆的な手法として注目され、光触媒活性に優れた二酸化チタン表面での金の成長がよく調べられている。一方、高屈折率の薄膜に周期的な溝を刻んだナノ格子へ斜めから光を入れると、特定の波長と入射角で光が薄膜内の導波モードへ結合し、格子付近の電場が強まる導波モード共鳴が生じる。共鳴条件は格子周期と入射角で調整できる。

　しかし、従来の光触媒的成長は、遮光マスクで照射領域を制限するか二酸化チタン自体を微細加工して場所を決めており、外部からの光刺激に応じて成長位置を変える柔軟さに乏しい問題点がある。また二酸化チタンはそれ自体が光触媒活性をもつため、共鳴を伴わない照射では金の粒子が表面全体に散らばる問題点がある。

　そこで、本研究では二酸化チタンにナノ格子を刻んだ光学テンプレートを作製し、導波モード共鳴が生じる入射角で単色レーザーを照射することによって解決した。まず発光層を載せた試料で格子周期に応じた発光増強を確かめ、繰り返し数の少ない六方格子では共鳴が鈍る代わりに結合する周期の範囲が広がることを示した。次に発光層を除き、塩化金酸の溶液を満たした流路内で2時間照射したところ、共鳴条件では金の細線が密に形成され、非共鳴では粒子が散在するにとどまった。周期170nmの格子で最も強い細線形成が得られた。Cobolt社製の紫外レーザーZouk（355nm、10mW）は、金成長に適した励起波長をもつ単色光源として、この共鳴結合を起こすために用いられた。

※本記事は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）を、独自の構成（背景・従来の問題点・結果）で再構成した日本語要約です。

【用語解説】

• 導波モード共鳴：薄い高屈折率層に周期的な格子を設けると、特定の波長と入射角の光が層内を伝わる導波モードへ結合し、反射や透過が急峻に変化するとともに格子近傍の電場が強まる現象。
• 光触媒的な金成長：光を吸収した半導体の中に生じた電子が溶液中の金イオンを還元し、表面に金属の金を析出させる過程。光を当てた場所だけに金属を作れる。
• 神経模倣計算：神経細胞の結合が刺激に応じて強まったり失われたりする性質をまねて情報処理を行う計算方式。配線が固定された従来の回路とは異なり、素子の結合そのものが書き換わる。

光触媒的な金成長の共鳴励起に使用された355 nmレーザー

　神経の軸索を何重にも取り巻く脂質に富んだ膜であるミエリンは、電気的な絶縁体として跳躍伝導を担うほか、軸索へ栄養を供給する役割も近年判明した。ミエリンの微細な形態変化は、多発性硬化症などの疾患の本質に迫る手がかりとして注目されている。試料を染めずに観察する手法として、三つの光子が入射光の三倍の周波数をもつ一つの光子に変わる三次高調波発生（THG）顕微鏡がある。均質な媒質では焦点の前後で生じた光が打ち消し合うため、屈折率などが変わる界面だけが明るく写る。THGでは光子が吸収も放出もされないため試料への負担も小さい。

　しかし、免疫組織化学染色は形態の同定には優れるものの、変化が進む過程を時間を追って捉えられないという問題点がある。色素を細胞へ導入する手法も、色素自体が生命現象を乱す恐れを伴う。加えて、これまでの無標識観察は固定した組織や採取直後の試料で検証されており、ヒト脳組織を長時間生かしたまま観察する系がなかった。THG顕微鏡自体も、高い照射強度を要するため光損傷の懸念が残されていた。

　そこで本研究では、切除したヒト脳組織を人工脳脊髄液中で維持する培養手順と、自作の高次高調波発生顕微鏡とを組み合わせることによって解決した。まず培養細胞への照射実験で光損傷が増えない条件を定め、1パルスあたり約4.5 nJ、毎マイクロ秒3.75パルスを採用した。この条件で側方約400 nm、光軸方向約1.3 µmの分解能を得て、ミエリン鞘の膨隆を染色像と同等に描出した。さらに細胞外ナトリウム濃度を段階的に上げながら数時間の撮像を続け、多発性硬化症患者の脳梁では対照より膨隆が有意に多いこと、蛋白質分解酵素の阻害剤で膨隆の増加が抑えられることを示した。HÜBNER Photonics社のVALOフェムト秒レーザー（波長1050 nm、パルス幅100 fs）は、この非線形過程を励起する光源として用いられた。

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【用語解説】

• 三次高調波発生（THG）：強い光を物質へ集めたとき、三つの光子がまとまって入射光の三倍の周波数（三分の一の波長）をもつ一つの光子に変わる非線形光学現象。屈折率や非線形感受率が急に変わる界面で強く生じるため、脂質に富む膜構造が標識なしで写る。
• 器官型切片培養：脳などの組織を細胞に分散させず、切片のまま組織構造を保って培養する手法。細胞同士の位置関係が残るため、生体に近い状態で長時間の観察ができる。
• ミエリン膨隆：ミエリン鞘が軸索から部分的に剥がれ、層の間が広がって膨らんだ状態。多発性硬化症では、脱髄が見られない白質にも生じることが報告されている。

三次高調波発生顕微鏡に使用されたフェムト秒レーザー

　物質の中を自然に伝わる音波と光が相互作用して生じるブリルアン散乱は、散乱光の周波数のずれから音速、すなわち弾性率を求められることから、試料を染めず壊さずに力学的性質を測る手段として近年急速に研究が進められている。細胞や組織の硬さは構造の維持や機能の発現、病気の成り立ちとも深く関わる。線幅の狭いレーザーと高分解能の干渉計、焦点から外れた光を小孔で遮る共焦点顕微鏡を組み合わせた共焦点ブリルアン散乱顕微分光により、硬さの三次元分布を捉えられるようになった。

　しかし、共焦点ブリルアン散乱顕微分光は、ブリルアン散乱光が極めて弱いため、同時に生じる強いレイリー散乱や光学部品からの反射迷光が背景光となり、目的の信号が埋もれてしまう問題点がある。屈折率の異なる界面を多く含む組織や厚い窓越しの液体では背景光がとりわけ強く、深部の評価は難しい。

　そこで、本研究では、対物レンズの瞳の中心を外して細い照明光を入射する軸外し照明と、同じ対物レンズで後方散乱光を集める後方集光とを組み合わせることによって、解決した。これにより界面からの強い反射光は集光されない。照明光を細く絞るため空間分解能は下がるものの、水とメタノールのブリルアン信号を明瞭に分離できた。電解質を含む牛血清アルブミン水溶液を厚い石英窓越しに20 wt%まで測ると、周波数のずれと線幅がともに濃度とともに増大し、タンパク質を取り囲む水和水の寄与を組み込んだ二相模型で説明できた。Cobolt社製の単一周波数固体レーザー（Samba、波長532 nm、線幅1 MHz未満）を照明光源に用いており、その狭い線幅がGHz程度のわずかな周波数のずれの分離を可能にした。

※本記事は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）を、独自の構成で再構成した日本語要約です。

【用語解説】

• ブリルアン散乱：物質の中を自発的に伝わる音波によって光が散乱され、その運動に応じて入射光から1 GHz程度周波数がずれる現象。ずれの大きさは媒質中の音速に比例し、線幅は音波の減衰、すなわち粘性を反映する。
• 後方集光：試料に光を当てた対物レンズで、そのまま後方へ戻ってくる散乱光を集める配置。試料の反対側に検出光学系を置けない厚い試料や生体組織の測定に適する。
• 水和水：タンパク質などの溶質の表面に束縛され、自由に動く水とは異なる運動性を示す水分子。溶液全体の粘弾性に無視できない寄与をする。

ブリルアン散乱顕微分光に使用された532 nmレーザー