蛍光顕微鏡は、生体の構造と機能を可視化できることから、生命現象の解明に欠かせない手法である。複数の蛍光標識を同時に追う場合、発光波長域が数 nm しか離れていない色どうしは、特定の波長帯だけを通して色を分ける従来の方式では分離できず、組織自身が出す自家蛍光も広い波長域で重なる。これに対し、各画素で連続した発光スペクトルを取得するハイパースペクトル蛍光撮像では、測ったスペクトルを各成分のスペクトルの重ね合わせとみなして係数を解くことで、重なった蛍光体と自家蛍光の寄与を成分ごとの量として取り出せる。ゼブラフィッシュのような中規模のモデル生物では、細胞の動態と個体全体の応答を同時に追える点で、この手法の価値が高い。

　しかし、生体内でのこの撮像は光子が足りないという問題がある。動きのある試料では露光時間を短くせざるを得ず、生体への負担を抑えるため励起強度も下げる必要があるうえ、わずかな蛍光光子を数百の波長帯に分割するため、1 帯域あたりの光子数が極端に少なくなる。その結果、散乱・散弾雑音・熱雑音が信号と深く結びつき、既存の深層学習による雑音除去は見た目を整えても本来のスペクトル構造を平滑化して壊してしまい、後段の成分分解が破綻する。教師データの作成自体が難しいという制約もある。

　そこで、本研究では光学系と演算処理を同時に開発することによって、解決した。共焦点の線走査方式によるハイパースペクトル・ライトシート蛍光顕微鏡を自作し、照明の線走査と検出側の逆走査を同期させて分光器へ導くことで、散乱と光毒性を抑えつつ光切片性を得た。ここでは Cobolt 社の多波長光源 Skyra の 488 nm 出力を走査鏡で振り、視野に線状の励起光として照射する構成をとっており、横方向 2.77 µm・深さ方向 4.84 µm の分解能を得ている。演算側では、二経路の残差注意機構と非負値行列因子分解を結合した深層学習網（DsRAN-NMF）を提案した。既存手法に対しスペクトル角で約 26.8〜42.4 %、PSNR で 3.12〜4.7 dB 改善し、6〜13 組という少数の教師データでも性能を保った。生きたゼブラフィッシュを 35 µW・30 ms の低励起条件で撮像し、血管とナノプラスチックを分離したうえで、暴露後 36〜72 時間で体節間血管内の蓄積が約 5 倍に増えることを示した。

※本記事は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）を、独自の構成で再構成した日本語要約です。

【用語解説】

• スペクトル成分分解（アンミキシング）：各画素で得た混合スペクトルを、既知または推定した成分スペクトルの重ね合わせとして解き、成分ごとの寄与量に分ける処理。
• ライトシート蛍光顕微鏡：試料を薄い板状の光で横から照らし、その面だけを直交方向から撮像する方式。面外を励起しないため退色と光毒性が小さい。
• 非負値行列因子分解（NMF）：行列を、負の値を含まない二つの行列の積に近似分解する手法。強度が負にならない分光データの成分分離と相性がよい。

ライトシート照明の線状励起に使用された488 nmレーザー（Cobolt Skyra）

　減数分裂において相同染色体の対合・組換え・分離を司るシナプトネマ複合体（SC）は、有性生殖に不可欠な多タンパク質複合体であり、その分子構造の解明は重要な研究課題である。SCは二本の側方要素、中央要素、および両者を連結する横糸フィラメントからなる梯子状の保存された構造を有する。従来、このような多タンパク質複合体の微細構造の解析には電子顕微鏡が必要であった。試料を膨潤性含水ゲルに包埋して物理的に膨張させることで、通常の蛍光顕微鏡でも回折限界を迂回できる膨張顕微鏡法（ExM）が開発され、約70 nmの横方向分解能での観察が可能となっている。

　しかし、高倍率の膨張は標識密度を著しく低下させ、構造分解能の劣化を招く問題があった。加えて、三次元的な等方的膨張や多タンパク質複合体の超微細構造が忠実に保存されるかについても疑問が残されていた。さらに、超解像顕微鏡法の一つであるdSTORMは高い空間分解能を提供するものの、光スイッチング緩衝液の最適化が必要なため同時に二色までの観察に制限されていた。

　そこで、本研究ではタンパク質膨張解析法（MAP）と構造化照明顕微鏡法（SIM）を組み合わせたMAP-SIM法を開発し、マウス精母細胞のSCを20〜30 nmの空間分解能で三色同時超解像観察することに成功した。MAP法は約4.2倍の等方的膨張と分子構造の保存を達成し、膨張後に免疫標識を行うことで従来到達できなかった抗原部位への標識効率の向上と連結誤差の低減を実現した。その結果、SC中央領域のタンパク質が単純な層状構造ではなく複雑な網目状構造を形成していること、また側方要素が二本以上の副側方要素に分岐する様子を光学顕微鏡で初めて可視化した。大視野三次元撮像に用いた再走査型共焦点顕微鏡にはCobolt社製Skyra多波長光源（405、488、561、640 nm）が励起光源として使用された。

【用語解説】

dSTORM：有機蛍光色素の確率的な光スイッチング現象を利用して個々の分子の位置を逐次的に決定し、回折限界以下の分解能で画像を再構築する超解像顕微鏡法の一種である。

シナプトネマ複合体（SC）：減数分裂の前期Iにおいて相同染色体間に形成されるタンパク質構造体。染色体の対合と遺伝的組換えの場を提供し、正常な配偶子形成に必須である。

膨張顕微鏡法（ExM）：試料を膨潤性含水ゲルに包埋し、物理的に数倍に膨張させることで、通常の蛍光顕微鏡でも回折限界を迂回した高分解能観察を可能にする手法である。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいております。

実験に使用されたCobolt Skyra

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　ライトシート蛍光顕微鏡（LSFM）は、近年、組織透明化技術と組み合わせることで、組織、臓器、さらには全身の三次元（3D）イメージングにおいて急速に研究が進められている。特に、選択面照明顕微鏡（SPIM）やデジタルスキャニングライトシート顕微鏡（DSLM）は、組織透明化技術が普及する以前から、小型で透明な標本の3Dおよび4Dイメージングに使用されてきた。これらの技術は、ガウシアンビームを集光して励起ライトシートを生成し、軸方向の空間分解能と有効視野（eFOV）のトレードオフを引き起こすが、タイルリングLSFMや軸方向スイーピング方式によって、軸方向の空間分解能を維持しつつeFOVを拡大することに成功している。さらに、BesselビームやAiryビーム、光格子ベースのライトシートなど、非回折ライトシートを利用する最新のアプローチも報告されている。これにより、LSFMは迅速でボリュームのあるクリアな組織イメージングに最適化されている。

　しかし、LSFMシステムの限られたアクセス性は、多くの組織透明化技術のエンドユーザーにとって大きな障害となっている。市販システムは使いやすさを提供する一方で、個々の研究グループにとっては高額であるため、導入が困難である。また、最先端のカスタムビルド顕微鏡は、高度な光学知識を必要とし、構築が難しい。さらに、多くのLSFMは励起および検出対物レンズの直交配置を採用しており、標本のサイズや取り付けに物理的な制約がある。従来の標本ホルダーである培養皿やウェルプレートは、顕微鏡に容易に収容することができないため、操作性に課題がある。

　そこで、本研究では、descSPIM（デスクトップ装備のSPIM：cleared標本用）を提案する。descSPIMは低コスト（20,000～50,000ドル）、低専門知識（非専門家による1日での設置可能）でありながら、実用的なDIYライトシート顕微鏡である。このシステムは、基本的なSPIM構成を採用し、単一ベンダー（Thorlabs）から購入可能な約90の部品で構成されており、ユーザーの利便性を考慮している。シングルモードファイバーガイドのレーザー光をコリメートし、円筒レンズを用いてシート照明を形成する。ユーザーは実験目的に応じてカラーバリエーションを選択可能で、マルチチャネルイメージングに対応している。さらに、基本構成を用いても、3.45×3.45×7-25 µm³のボクセル解像度で効率的な3Dイメージングが可能であり、迅速な3Dイメージングを実現する。

※この要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。

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ライトシート顕微鏡で使用されたCobolt Skyra