Yuan, T., Riobo, L., Gasparin, F., Ntziachristos, V., Pleitez, M.A. “Phase-shifting optothermal microscopy enables live-cell mid-infrared hyperspectral imaging of large cell populations at high confluency.” Science Advances 10, eadj7944 (2024). https://doi.org/10.1126/sciadv.adj7944
生細胞の代謝を非侵襲的に観察する手法として、分子の振動エネルギー準位遷移を利用した振動分光顕微鏡が近年注目されている。この手法は、蛍光標識を必要とせず、脂質・タンパク質・糖質といった生体分子を固有の化学コントラストで識別できる点で非常に有用である。とりわけ、各画素が幅広い振動スペクトル情報を持つハイパースペクトル画像を取得できれば、生細胞の代謝状態を定量的かつ網羅的に解析することが可能となる。また、多数の細胞を同一視野で観察するためには広い撮像視野（FOV）が不可欠であり、細胞が高密度に充填された状態（コンフルエント状態）での計測は、細胞が生体内に近い環境で示す分化挙動などの生理的現象を正確に捉えるために重要である。
中赤外（mid-IR）光の吸収断面積はラマン散乱の約10億倍に達することから、光熱効果と光学的位相コントラスト検出を組み合わせた広視野mid-IR顕微法は、高速な超分光撮像を実現する有力な手段として期待されている。
しかし、従来の広視野光熱顕微鏡には大きな問題点がある。mid-IR吸収によって生じる微小な位相変化（MIR位相）は、試料固有の屈折率に起因する背景位相（固有位相）より2〜3桁も小さく、これをHilbert変換や非線形位相アンラッピングといった後処理で除去しようとすると、弱いMIR位相信号が改変されて検出感度が著しく低下する。さらに、高密度なコンフルエント細胞では固有位相の位相折り返しが顕著となり、従来の定量的位相顕微法では正確な画像取得が困難であった。加えて、先行手法（BSTP・MV-QPI）は高速撮像を実現するものの、撮像視野が10〜50 µmと極めて狭く、細胞集団の統計的解析に必要な100 µm以上のFOVを達成できていなかった。
そこで、本研究では偏光を利用した位相シフト機構（PSM）を組み込んだ位相シフト光熱顕微鏡（PSOM）を開発することによって、上記の問題点を解決した。PSOMは試料の固有位相を光学的に相殺しながらMIR位相のみを抽出するため、後処理を必要とせず、雑音等価位相を0.26 mradと最先端比で4分の1に低減することに成功した。その結果、最大5.18×10⁵ µm²という従来比50倍の撮像視野でのハイパースペクトル撮像と、細胞密度100%のコンフルエント状態にある生細胞の中赤外イメージングを世界で初めて実現した。さらに、照射強度は従来の振動顕微法（CARS等）と比較して4桁低く抑えられ、細胞生存率85.4%（2時間照射後）という高い安全性も確認された。なお、本研究では532 nmパルスレーザー（Cobolt 06-Tor、繰り返し周波数2 kHz）をプローブ光として使用し、mid-IRポンプ光によって誘起される光熱的位相変化を偏光干渉計で検出するための参照・試料ビームの光源として機能させた。
※本要約は、オープンアクセス論文（CC BY 4.0）に基づいています。
使用された532nmパルスレーザー
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